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Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 10165 (2022) Citar este artículo

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La familia de genes de la proteína de dedos de zinc C2H2 (C2H2-ZFP) desempeña funciones importantes en respuesta al estrés ambiental y varios otros procesos biológicos en las plantas. El ginseng es una preciosa hierba medicinal cultivada en Asia y América del Norte. Sin embargo, se sabe poco sobre la familia de genes C2H2-ZFP y sus funciones en el ginseng. Aquí, identificamos 115 genes C2H2-ZFP del ginseng, definidos como la familia de genes PgZFP. Se agrupó en cinco grupos y presentaba ocho motivos conservados, y cada gen contenía de uno a seis de ellos. Los genes de la familia se clasifican en 17 subcategorías de ontología genética y tienen numerosos elementos reguladores que responden a una variedad de procesos biológicos, lo que sugiere su diferenciación funcional. Los 115 genes PgZFP se fusionaron en 228 transcripciones en la etapa de establecimiento de semillas y su expresión varió dramáticamente entre tejidos, etapas de desarrollo y genotipos, pero forman una red de coexpresión, lo que sugiere su correlación funcional. Además, se identificaron cuatro genes, PgZFP31, PgZFP78-01, PgZFP38 y PgZFP39-01, de la familia de genes que participaban activamente en la respuesta de las plantas al estrés salino. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el origen, diferenciación, evolución y función de la familia de genes PgZFP y nuevos recursos genéticos para la investigación y aplicación del gen C2H2-ZFP en ginseng y otras especies de plantas.

El ginseng, como valiosa hierba medicinal, se ha utilizado ampliamente en alimentos, medicinas y cosméticos para la salud humana. Se ha demostrado que sus principales ingredientes bioactivos, los ginsenósidos, previenen, inhiben y tratan varios tipos de cáncer1,2,3. Por lo tanto, en los últimos años se ha llevado a cabo extensamente la investigación del genoma del ginseng. Xu et al.4 informaron sobre el primer borrador del genoma del ginseng. Kim et al.5 publicaron el borrador del genoma del ginseng para otro genotipo, del que se identificaron 59.352 genes. Recientemente, Wang et al.6 informaron de un ensamblaje del tamaño de un cromosoma del genoma del ginseng para el tercer genotipo, a partir del cual se identificaron 65.913 genes. Wang et al.7 secuenciaron el transcriptoma de una planta de ginseng de 4 años expresada en 14 tejidos, ensamblaron 248.992 transcritos unigenes empalmados a partir de 130.557 modelos genéticos y cuantificaron sus expresiones en los 14 tejidos. Estos recursos genómicos y transcriptómicos han proporcionado herramientas útiles para la identificación y caracterización de genes importantes para la investigación y el mejoramiento del ginseng en todo el genoma.

Se ha demostrado que la familia de genes de la proteína de dedos de zinc (ZFP) C2H2 desempeña funciones importantes en la respuesta de las plantas al estrés abiótico y biótico, el crecimiento y desarrollo de las plantas y la transducción de señales hormonales. Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen C2H2-ZFP de Arabidopsis, ZAT18, mejoró la tolerancia a la sequía8. El gen bsr-d1 del arroz que codifica un factor de transcripción C2H2 aumentó la resistencia a las enfermedades y la inmunidad contra el añublo del arroz9. El gen SlZFP2 del tomate participó en la regulación de la biosíntesis de ABA durante el desarrollo del fruto, inhibiendo así el desarrollo del fruto mediante la inhibición transcripcional del regulador de la floración10. Se ha informado que la familia de genes C2H2-ZFP participa activamente en la respuesta de las plantas al estrés salino, lo cual es importante para la producción de cultivos11. La expresión de un gen C2H2-ZFP del tomate, SlZF3, mejoró la tolerancia a la sal de la planta12. La expresión de Zoysia japonica ZjZFN1 en Arabidopsis mejoró la germinación de las semillas, la adaptabilidad de las plantas al estrés salino y el porcentaje de cotiledones verdes bajo la condición de estrés salino13. Los genes AZF y STZ en Arabidopsis tenían actividades de represión transcripcional, respondiendo así al estrés salino14. Se demostró que el gen OsZFP213 del arroz interactúa con OsMAPK3, mejorando así la tolerancia a la sal15. En soja y Arabidopsis, GmZAT4 jugó un papel importante en la tolerancia al estrés de PEG y NaCl y en la respuesta de ABA16.

Por lo tanto, los genes de la familia de genes C2H2-ZFP se han identificado y caracterizado en todo el genoma en especies de plantas serval, incluida Arabidopsis que contiene 176 genes C2H2-ZFP17, arroz (189)18, álamo (109)19, Medicago truncatula (218 )20, maíz (211)21 y soja (321)22. La familia de genes C2H2-ZFP generalmente se expresa como X2CX2–4CX12HX2–8H, donde X representa cualquier aminoácido y el número indica el número de aminoácidos23. Se caracteriza por su proteína de dedos de zinc C2H2 que forma enlaces de coordinación con dos pares de residuos de cisteína e histidina y además forma una estructura tetraédrica compacta en forma de dedo a través de horquillas β y hélices α24. Además, la familia de genes contiene algunos dominios conservados, incluido el dominio de unión al ADN, el dominio regulador de la transcripción y el dominio de interacción de proteínas23. El dominio de unión al ADN se caracteriza por un motivo QALGGH altamente conservado en el que cada aminoácido es importante para su actividad de unión al ADN. La ausencia del motivo QALGGH en un gen C2H2-ZFP puede reducir la sensibilidad a ABA y, por tanto, el tamaño de los estomas25, e influir en el desarrollo de la inflorescencia26. Otra característica única de la familia de genes es la variación de la longitud del espaciador entre dos dedos de zinc adyacentes de la proteína de dedos de zinc C2H2, que también puede afectar la unión al ADN23. Además, algunas C2H2-ZFP contienen una secuencia de aminoácidos altamente conservada (L/FDLNL/FxP), conocida como motivo EAR, en la región carboxi terminal27. El motivo EAR es el dominio de represión de la transcripción más pequeño conocido. Cuando un solo residuo en el motivo EAR cambió, la capacidad de represión de la transcripción se redujo considerablemente o desapareció28. Los tres aminoácidos DLN del motivo hexapéptido son indispensables para la inhibición transcripcional y la presencia de al menos dos residuos DLN produjo una inhibición transcripcional máxima29.

Sin embargo, no se ha informado de la familia de genes C2H2-ZFP en el ginseng. En el presente estudio, identificamos 228 transcripciones del gen C2H2-ZFP empalmadas de 115 genes C2H2-ZFP del ginseng Jilin, definimos genes PgZFP y los caracterizamos en diversidad genética, evolución, expresión, diferenciación funcional e interacción gen x gen. Además, identificamos cuatro genes PgZFP implicados en la respuesta del ginseng al estrés salino, confirmando así el papel de la familia en la respuesta de las plantas al estrés salino. Por lo tanto, los hallazgos de este estudio brindan una visión integral de la familia de genes PgZFP en el ginseng, el conocimiento y los recursos genéticos necesarios para la investigación avanzada y el mejoramiento del ginseng y especies relacionadas.

Para este estudio se utilizaron tres conjuntos de materiales vegetales de ginseng Jilin (Figura complementaria S1A). Estos materiales vegetales incluyeron 14 tejidos de un cv de 4 años. Planta Damaya, raíces de cv. de 5, 12, 18, 25 años. Plantas de Damaya y raíces de plantas de 4 años de 42 cultivares (en adelante denominados genotipos) codificados del S1 al S42 (Tabla complementaria S1). Todas las semillas de estos materiales vegetales procedían de nuestro laboratorio y están disponibles previa solicitud. Los 14 tejidos del cv. La planta de Damaya incluyó raíz de fibra, raíz de la pierna, epidermo de la raíz principal, corteza de la raíz principal, raíz del brazo, rizoma, tallo, pedúnculo de la hoja, pedicelo del folíolo, lámina de la hoja, pedúnculo del fruto, pedicelo del fruto, fruto y semilla7. Las raíces de plantas de 5, 12, 18 y 25 años se recolectaron de un cultivar, Damaya. Los 42 genotipos se recolectaron del centro de origen y diversidad del ginseng, provincia de Jilin, China, donde se produjo más del 65% del ginseng mundial. Estos genotipos eran representantes de la diversidad genética del ginseng Jilin.

Para facilitar la investigación de la genómica funcional del ginseng, previamente desarrollamos varias bases de datos de genes funcionales para el ginseng Jilin. Estas bases de datos incluían la base de datos de expresión y secuencia genética en los 14 tejidos anteriores de la planta de 4 años (Base de datos A)7, la base de datos de expresión y secuencia genética de las raíces de plantas de cuatro años diferentes (Base de datos B)7, y la base de datos de secuencia y expresión genética de raíces de plantas de 4 años de edad de 42 genotipos (Base de datos C)30. Estas bases de datos se utilizaron para este estudio. La base de datos A consta de 248.992 transcripciones únicas, con 59.092–113.456 transcripciones únicas por tejido. La base de datos B contiene entre 54.444 y 65.412 transcripciones únicas por raíz de planta de un año. La base de datos C está compuesta por 48.211–79.134 transcripciones únicas por genotipo. Además, para este estudio también se utilizaron tres ensamblajes del genoma de ginseng de tres genotipos4,5,6.

La base de datos A se utilizó para identificar los genes C2H2-ZFP en el ginseng. Primero, recuperamos el modelo oculto de Markov (HMM) C2H2-ZFP (familia de proteínas: PF00096) de la base de datos Pfam (Pfam 33.1; https://pfam.xfam.org/)31, utilizado como consultas para buscar en la base de datos A de ginseng. Genes C2H2-ZFP e identificaron los genes putativos C2H2-ZFP en el ginseng. Luego, los supuestos genes C2H2-ZFP de ginseng identificados se importaron a iTAK (//bioinfo.bti.cornell.edu/tool/itak) para confirmar aún más los supuestos genes C2H2-ZFP mediante la búsqueda conservadora del dominio C2H2-ZFP32. Los supuestos genes C2H2-ZFP que se confirmó que tenían los dominios C2H2-ZFP se consideraron genes codificadores de ginseng C2H2-ZFP y se definieron como genes PgZFP (Tabla complementaria S2). Finalmente, se utilizó el buscador de ORF (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) para identificar los ORF de los genes PgZFP. Se predijeron los indicadores fisiológicos y bioquímicos relevantes de sus supuestas secuencias de proteínas, incluido el punto isoeléctrico (PI), el peso molecular (Da), el gran promedio de hidropaticidad, el índice de inestabilidad y el índice alifático, utilizando Protparam (https://web.expasy. org/protparam/).

Alineamos los genes PgZFP identificados anteriormente con tres conjuntos de genoma de ginseng4,5,6 utilizando Blastn para determinar su distribución en el genoma de ginseng6 y la variación del tamaño de la familia del gen PgZFP entre genotipos. Para la alineación se utilizaron los criterios de identidad ≥ 99%, longitud de cobertura ≥ 200 pb y valor e ≤ 1,0E-100. Los genes PgZFP se alinearon con el genoma de Arabidopsis con criterios de identidad ≥ 75%, longitud de cobertura ≥ 80 pb y valor e ≤ 1.0E-10, dado que el ginseng está relacionado lejanamente con Arabidopsis (Figura complementaria S1B) 33. La distribución de la familia de genes en el genoma del ginseng y su sintenia con el genoma de Arabidopsis se construyeron utilizando el paquete R Circlize34. Los genes alineados con cada ensamblaje del genoma se compararon para identificar los transcriptomas pan y central de la familia de genes entre los tres genotipos de ginseng.

Para determinar el origen, la evolución y la filogenia de la familia de genes PgZFP, seleccionamos los ORF de las transcripciones de los 115 genes PgZFP utilizando el buscador NCBI ORF (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ ), calcularon la relación Ka/Ks de los genes PgZFP recientemente duplicados, construyeron su árbol filogenético y predijeron sus dominios conservados. Las transcripciones con CDS completo se utilizaron para el cálculo de Ka/Ks utilizando KaKs_Calculator35. El tiempo de duplicación y divergencia del gen se estimó mediante T = Ks/2λ × 10−6, donde Ks es la tasa de sustitución de nucleótidos sinónimos y λ es el número de sustituciones por sitio sinónimo por generación, para lo cual λ = 6,5 × 10−9 fue utilizado36,37,38.

La transcripción que tiene la secuencia de aminoácidos más larga para un gen PgZFP se utilizó para construir el árbol filogenético de la familia de genes. El árbol filogenético se construyó utilizando el método de máxima verosimilitud (ML) de MEGA X39, con 1000 replicaciones bootstrap. Se descargaron cuarenta y cinco C2H2-ZFP de Arabidopsis de la base de datos de factores de transcripción de plantas (//plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/) y se utilizaron como grupo externo y referencia evolutiva.

Se utilizó MEME40 para predecir los dominios conservados en las transcripciones del gen PgZFP. Las supuestas secuencias de proteínas de los 26 genes PgZFP que tienen los dominios conservadores completos se utilizaron como representantes para la predicción del dominio conservado de los genes. La longitud del motivo se estableció entre 10 y 50 aminoácidos y el número máximo de motivos se estableció en 6, 8 y 10, respectivamente, mientras que otros parámetros se establecieron por defecto.

Los estudios han documentado que los tipos de elementos reguladores cis de genes, como los promotores, están relacionados con la funcionalidad biológica de los genes, como las respuestas de las plantas a las hormonas, el estrés abiótico y biótico, y el crecimiento y desarrollo de las plantas. Estimamos la diferenciación funcional y la divergencia de los genes de la familia de genes PgZFP mediante categorización de ontología genética (GO) y análisis de secuencia de elementos reguladores cis. Las transcripciones del gen PgZFP se clasificaron en GO utilizando Blast2GO V5.041. El enriquecimiento del número de transcripciones del gen PgZFP categorizadas en cada subcategoría se probó mediante la prueba de Chi-cuadrado utilizando la categorización de las transcripciones expresadas en la planta de ginseng de 4 años como control7. Se analizaron las secuencias aguas arriba de 1500 pb de los genes PgZFP, se identificaron los elementos reguladores en cis de los genes y se clasificaron los tipos de elementos reguladores en cis utilizando la base de datos PlantCARE42.

Caracterizamos la familia de genes PgZFP mediante el análisis de las expresiones, mapas de calor y redes de coexpresión de sus transcripciones genéticas en 14 tejidos de una planta de 4 años, en plantas de 5, 12, 18 y 25 años. raíces de plantas viejas y en raíces de plantas de 4 años de 42 genotipos. Las expresiones de las transcripciones del gen PgZFP se extrajeron de las bases de datos A, B y C, respectivamente. Los mapas de calor de expresión de los genes se construyeron utilizando un paquete de lenguaje R para la construcción y visualización de mapas de calor. Las redes de coexpresión de los genes se construyeron utilizando el software BioLayout Express3D Versión 3.243. Además, probamos la tendencia de que las transcripciones del gen PgZFP formaran una red de coexpresión mediante la prueba t de Student utilizando 176 transcripciones seleccionadas al azar de las 228 transcripciones del gen PgZFP identificadas en este estudio con el mismo número de transcripciones seleccionadas al azar de la base de datos A como una control. La prueba se llevó a cabo con una serie de valores de corte de P ≤ 5,0E-02 a 1,0E-08, con 20 repeticiones por valor de corte. Además, identificamos los genes centrales de la red de la familia de genes PgZFP utilizando los siguientes criterios: valor P de corte de la red ≤ 0,001, conectividad ≥ 30 y el porcentaje de genes centrales en el número total de genes en la red ≤ 5%. La conectividad de un gen en una red indica no sólo el grado de correlación de su coexpresión con otros genes, sino también el número de genes con los que interactúa en la red.

Para examinar la función potencial de la familia de genes PgZFP en respuesta al estrés salino, enfatizamos el ginseng con la sal de NaCl utilizando sus raíces adventicias como materiales experimentales. Las raíces adventicias de 1 cm se cultivaron y se estresaron en medio B5 que contenía NaCl 0 mM, 20 mM, 40 mM y 80 mM a 25 oC durante 30 días. Se midieron las longitudes de las raíces, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ℃ para el análisis de la expresión genética.

Primero analizamos los genes PgZFP alineándolos con los genes que responden a la sal identificados en A. thaliana, STZ y AZF. Luego se seleccionaron los genes PgZFP que estaban mejor alineados con los genes STZ y AZF y se sometieron a un análisis de expresión comparativo utilizando las raíces adventicias de ginseng estresadas con y sin sal mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para probar si los genes del gen PgZFP La familia responde al estrés salino. Los cebadores qPCR de los genes PgZFP seleccionados se diseñaron en función de sus secuencias (Tabla complementaria S3). El ARN total se aisló de las raíces adventicias estresadas con las diferentes concentraciones de NaCl anteriores utilizando el método Trizol. El ARNm se purificó a partir del ARN total y el ADNc de primera cadena se sintetizó y utilizó como plantillas de qPCR. El gen CYP se utilizó como gen de referencia44. La qPCR se realizó utilizando el sistema en tiempo real Applied Biosystems 7500 (ABI, EE. UU.) y el kit de mezcla Ultra SYBR (Low ROX) (ComWin, Beijing, China). Se empleó el método 2-ΔΔCT para determinar las expresiones relativas de los genes PgZFP.

Los autores confirman que todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Todos los materiales vegetales utilizados en este estudio procedían del laboratorio de los autores.

Se identificaron un total de 228 transcripciones del gen PgZFP, con una longitud de secuencia de 202 a 5327 pb y una longitud promedio de 1419 pb (Tabla complementaria S2). Estas transcripciones se cortaron a partir de 115 genes PgZFP, con de 1 a 20 transcripciones por gen y un promedio de 2 transcripciones por gen. Los pesos moleculares de las supuestas proteínas de las transcripciones del gen PgZFP variaron de 3.808 a 177.151 Daltons (Da), su punto isoeléctrico (PI) osciló entre 4,55 y 12,13, el gran promedio máximo de sus hidropaticidades fue 1,253 y el gran promedio mínimo de sus hidropaticidades fueron − 1.512. Dado que solo 16 de las transcripciones del gen PgZFP tenían un gran promedio positivo de hidropaticidad, especulamos que la mayoría de los genes de la familia de genes PgZFP codifican proteínas hidrofílicas. Los índices de inestabilidad de las supuestas proteínas PgZFP estaban entre 18,90 y 88,75, y la mayoría de ellos eran superiores a 40,00, lo que sugiere que la mayoría de los genes PgZFP en la familia de genes codifican proteínas inestables (Tabla complementaria S4).

Setenta y tres de los 115 genes PgZFP identificados en este estudio se asignaron a los 24 cromosomas del ginseng chino6, y cada cromosoma tenía de 1 a 6 genes PgZFP. Se demostró que diecisiete de los 73 genes PgZFP mapeados en el genoma del ginseng chino eran sintéticos de 11 ortólogos de Arabidopsis en cuatro de los cinco cromosomas de Arabidopsis, los cromosomas 1, 3, 4 y 5, y cada cromosoma tenía de 2 a 4 ortólogos de Arabidopsis (Fig. 1A). De los 115 genes PgZFP identificados en este estudio, 74 y 74 estaban alineados con los genomas del ginseng chino IR826 (Ref.4) y el ginseng coreano ChP5, respectivamente. El análisis comparativo mostró que el transcriptoma pan de la familia de genes constaba de 149 genes PgZFP y el transcriptoma central de la familia de genes contenía solo 12 genes PgZFP, lo que sugiere una amplia variación en el tamaño de la familia de genes entre los genotipos dentro de P. ginseng.

La distribución de la familia de genes PgZFP en el genoma del ginseng y la variación del tamaño de su familia entre los genotipos de ginseng. (A) Las posiciones de la familia de genes PgZFP en el genoma del ginseng chino6 y su sintenia con el genoma de Arabidopsis. Los genes PgZFP se asignaron a los 24 cromosomas de ginseng indicados por barras de color azul claro y sus ortólogos de Arabidopsis se asignaron a cuatro de los cinco cromosomas de Arabidopsis indicados por barras amarillas. (B) Diagrama de Venn que muestra los transcriptomas pan y central de la familia de genes PgZFP. Los números en el diagrama de Venn indican el número de genes PgZFP de la familia que son específicos de genotipo, compartidos entre los genotipos y comunes entre los tres genotipos. El porcentaje de genes se calculó mediante el número de genes dividido por el número total de genes PgZFP (221) alineados con el genoma de cada genotipo multiplicado por 100.

Primero estimamos el modo de duplicación y selección de los genes PgZFP en la familia de genes. El análisis de 20 pares de genes PgZFP que tienen ORF completos y que se han duplicado más recientemente reveló que estos genes se duplicaron y divergieron hace 18,0 a 40,7 millones de años (MYA). Aproximadamente el 55% de ellos han sido sometidos a selección purificadora (Ka/Ks < 1,0 ± 0,1), el 40% a selección neutra (Ka/Ks = 1,0 ± 0,1) y el 5% a selección positiva (Ka/Ks > 1,0 ± 0,1). ) (Tabla complementaria S5).

Para determinar el origen y la filogenia de la familia de genes PgZFP en el ginseng Jilin (Figura complementaria S1A), se utilizaron para el experimento las supuestas proteínas de las transcripciones más largas de los 115 genes PgZFP (Tabla complementaria S4). Cuarenta y cinco genes representativos de A. thaliana (At) C2H2-ZFP seleccionados de su árbol filogenético (Tabla complementaria S6) se utilizaron como grupo externo (Figura complementaria S1B) 33. Los genes PgZFP se clasificaron, con los genes AtC2H2-ZFP, en cinco grupos, definidos del I al V (Fig. 2). El grupo I incluía 26 genes PgZFP agrupados con los miembros de los grupos C1-2i, C1-3i, C1-4i y C1-5i de los genes AtC2H2-ZFP. El grupo II constaba de 25 genes PgZFP agrupados con los miembros de las subfamilias C2, C3, A3 y A4 de los genes AtC2H2-ZFP. El grupo III estaba formado por 46 genes PgZFP agrupados con los miembros de los grupos C1-1i, C1-2i, A1-a, A1-b y A1-c de los genes AtC2H2-ZFP. El grupo IV contenía 11 genes PgZFP agrupados con los miembros de la subfamilia AtC2H2-ZFP A2 y la familia B. El grupo V estaba constituido por 7 genes PgZFP agrupados con el único miembro de la subfamilia AtC2H2-ZFP C217. Estos resultados sugirieron el origen antiguo y la diversidad de la familia de genes PgZFP.

Filogenia de la familia de genes PgZFP. El árbol filogenético de la familia de genes PgZFP se construyó utilizando los 115 genes PgZFP y los genes C2H2-ZFP de Arabidopsis thaliana (At) como grupo externo. Las subfamilias de la familia de genes PgZFP están indicadas por I, II, III, IV y V. El árbol filogenético se construyó utilizando el método de máxima verosimilitud (ML) con 1000 replicaciones de arranque. El número cerca de cada grupo indica la confianza de arranque del grupo en porcentaje (%).

Además, analizamos los motivos conservados de la familia de genes PgZFP utilizando las proteínas putativas de 26 genes PgZFP representativos que tienen dominios conservados completos dentro de los ORF con criterios de longitud del motivo = 10–50 aminoácidos y un número máximo de motivos de 6, 8 o 10. Cuando se utilizó un número máximo de motivos de 6, se identificaron seis motivos conservadores. Cuando se empleó un número máximo de motivos de 8, se identificaron ocho motivos conservadores. Cuando se aplicó un número máximo de motivos de 10, se identificaron diez motivos conservadores. Sin embargo, los seis u ocho motivos de los genes PgZFP identificados con un número máximo de motivo de 6 u 8 eran completamente consistentes con los primeros seis u ocho de los 10 motivos de los genes identificados con un número máximo de motivo de 10. La Figura 3A muestra el ocho motivos conservados de los genes PgZFP identificados con el número máximo de motivo de 8, definidos del Motivo 1 al Motivo 8. El Motivo 1 se identificó en el 88,5% de los 26 genes PgZFP examinados (Fig. 3B), lo que indica la conservación evolutiva del gen PgZFP. familia. El QALGGH de los Motivos 1 y 2 juega un papel importante en la unión al ADN8. La EXEXXAXCLXXL (caja L) de Motif 4 es una región rica en leucina que se considera que desempeña un papel importante en las interacciones proteína-proteína23. El motivo 5, como dominio EAR, incluye la secuencia central DLNL y se ha demostrado que desempeña un papel importante en la inhibición transcripcional y la respuesta al estrés abiótico29,45.

Los motivos conservados y su distribución en los genes PgZFP. (A) Motivos conservados de proteínas PgZFP. (B) Distribución de motivos conservados en las proteínas PgZFP. El árbol filogenético de las proteínas PgZFP se construyó utilizando el método de máxima verosimilitud (ML).

Primero, categorizamos las transcripciones del gen PgZFP con ontología genética (GO). Las transcripciones del gen 228 PgZFP se clasificaron en las tres categorías funcionales principales, MF (función molecular), BP (proceso biológico) y CC (componente celular) (Fig. 4A). La categoría MF incluyó 88 transcripciones, de las cuales 27 fueron específicas de MF, 17 se clasificaron en categorías MF y CC, 13 se clasificaron en categorías MF y BP, y 31 se clasificaron en las tres categorías principales. La categoría BP incluyó 49 transcripciones, de las cuales 3 fueron específicas de BP, 2 se clasificaron en categorías BP y CC, y las transcripciones restantes se clasificaron con MF y con MF y CC como se indicó anteriormente. La categoría CC incluyó 56 transcripciones, de las cuales 6 eran específicas de CC y las transcripciones restantes se clasificaron con MF, con BP y con MF y BP como se indicó anteriormente. La categoría BP se clasificó además en ocho subcategorías en el nivel 2, de las cuales tres estaban enriquecidas en número de genes PgZFP (P ≤ 0,05 o 0,01) (Fig. 4B). La categoría MF se clasificó en tres subcategorías, actividad catalítica, unión y actividad reguladora de la transcripción, de las cuales los genes PgZFP implicados en la actividad catalítica se enriquecieron a la baja (P ≤ 0,01) y los implicados en la actividad reguladora de la transcripción o unión se enriquecieron al alza. (P ≤ 0,01). La categoría CC se clasificó en seis subcategorías, de las cuales dos estaban enriquecidas a la baja y dos enriquecidas al alza en el número de genes PgZFP (P ≤ 0,05 o 0,01). Estos resultados sugirieron la diferenciación funcional, divergencia y especialidad de los genes PgZFP.

(A) Categorización GO de las transcripciones del gen PgZFP. (B) Enriquecimiento de las transcripciones del gen PgZFP. BP, Proceso Biológico; MF, Función Molecular; CC, componente celular.

Además, examinamos si la categorización GO de la familia de genes PgZFP era consistente en todos los tejidos, etapas de desarrollo y genotipos. Los resultados mostraron que la familia de genes PgZFP se clasificó consistentemente en las mismas 17 subcategorías que las anteriores en el nivel 2 en todos los tejidos, etapas de desarrollo y genotipos (Figura complementaria S2). Sin embargo, el número de transcripciones del gen PgZFP categorizadas en cada una de las 17 subcategorías varió sustancialmente entre tejidos, etapas de desarrollo y genotipos.

A continuación, analizamos los elementos reguladores cis de los genes PgZFP, como los elementos promotores, debido a sus relaciones con las actividades de expresión génica y posibles funciones biológicas. Dado que 73 de los 115 genes PgZFP estaban alineados con el genoma del ginseng chino, se buscaron elementos reguladores cis en las secuencias ascendentes de 1500 pb de los 73 genes PgZFP. Se identificaron un total de 3709 elementos reguladores cis para los 73 genes PgZFP y estos elementos se clasificaron en 53 tipos, como TATA-box, CAAT-box, SARE, ARE, AuxRE y MBS. Estos elementos responden a las hormonas, el estrés ambiental y el crecimiento de las plantas (Figura complementaria S3A). De los 3709 elementos reguladores cis de los 73 genes PgZFP, 276 respondieron a hormonas, incluidas auxinas, giberelina, ácido salicílico, ácido abscísico y MeJA (Figura complementaria S3B); 149 a tensiones ambientales, incluida la defensa, la luz, las bajas temperaturas y la sequía (Figura complementaria S3C); y 82 al crecimiento de las plantas, como semillas, expresión de meristemas y expresión de endospermo (Figura complementaria S3D).

Caracterizamos las expresiones de la familia de genes PgZFP espacial, templada y entre genotipos recopilados en el centro de origen y diversidad del ginseng Jilin en diferentes aspectos. El análisis de una selección aleatoria de transcripciones de la familia de genes PgZFP mostró que las expresiones de diferentes transcripciones de genes variaban dramáticamente en un tejido, en una etapa de desarrollo o en un genotipo. Sin embargo, la expresión de una transcripción genética fue relativamente consistente en todos los tejidos, etapas de desarrollo y genotipos, aunque su expresión también varió entre tejidos, etapas de desarrollo y genotipos (Figura complementaria S4). De las 228 transcripciones de la familia de genes PgZFP identificadas en este estudio, solo entre el 54,4 y el 71,9% se expresaron en un solo tejido (Figura complementaria S5A) y entre el 27,6 y el 33,8% se expresaron en una única etapa de desarrollo de la raíz (Figura complementaria S5B). Cuarenta y seis de ellos se expresaron en las cuatro etapas de desarrollo de las raíces y 13, 5, 4 y 14 se expresaron específicamente en raíces de 5, 12, 18 y 25 años, respectivamente (Figura complementaria S5C). . Entre los genotipos estudiados, entre el 49,1 y el 64,5% de las transcripciones del gen PgZFP se expresaron en la raíz de la planta de 4 años de un genotipo (Figura complementaria S5D). El análisis del mapa de calor de expresión de transcripciones mostró que las expresiones de una gran mayoría de las transcripciones en la familia de genes PgZFP estaban reguladas de forma independiente en todos los tejidos, en las etapas de desarrollo y en los genotipos (Fig. 5). Solo se encontró que PgZFP94 y PgZFP80-05 estaban coregulados en todos los tejidos analizados (Fig. 5A); ninguno de los genes analizados estaba coregulado en las etapas de desarrollo de las raíces (Fig. 5B); y PgZFP36-02 y PgZFP36-03 estaban coregulados entre genotipos (Fig. 5C).

Mapas de calor de expresión de las transcripciones del gen PgZFP en 14 tejidos (A), cuatro raíces de diferentes edades (B) y raíces de 4 años de 42 genotipos (C).

El análisis filogenético anterior, la categorización GO y el examen del elemento regulador cis de la familia de genes PgZFP indicaron que la familia de genes se ha diferenciado sustancialmente en secuencia y funcionalidad. La pregunta es si persiste alguna relación entre los genes de la familia de genes PgZFP. Por lo tanto, realizamos un análisis de red de coexpresión con transcripciones del gen PgZFP. Los resultados mostraron que las 228 transcripciones de la familia de genes PgZFP formaron una única red de coexpresión fuerte (Fig. 6A). La red constaba de 228 nodos y 4745 bordes que estaban agrupados en ocho grupos (Fig. 6B). En comparación, la red de la familia de genes PgZFP era mucho más sólida que la de las transcripciones desconocidas de ginseng seleccionadas al azar (Fig. 6C, D). Las estadísticas mostraron que las transcripciones del gen PgZFP tenían más probabilidades de formar una red de coexpresión que las transcripciones desconocidas de ginseng seleccionadas al azar (Fig. 6E, F). Estos resultados sugirieron que aunque la familia de genes se ha diferenciado sustancialmente en secuencia y funcionalidad, las actividades de expresión de sus genes aún se mantienen correlacionadas, lo que indica su correlación funcional. Un análisis más detallado reveló que ocho de los 115 genes PgZFP, PgZFP79, PgZFP82, PgZFP114, PgZFP87, PgZFP01-02, PgZFP48, PgZFP63-04 y PgZFP30, probablemente desempeñaron funciones centrales en la red cuando se aplicó P ≤ 0,001; por lo tanto, es probable que estos genes sean los genes centrales, y cada gen tiene una conectividad de 30 a 43 (Figura complementaria S6). Además, intentamos alinear estos ocho genes PgZFP con el genoma de Arabidopsis, pero solo PgZFP79 y su gen parálogo, PgZFP79P, se alinearon con At3G48430 (REF6) en el genoma de Arabidopsis (ver Fig. 1). Se descubrió que este gen es un regulador positivo de la floración en una vía dependiente de FLC en Arabidopsis46.

La red de coexpresión de las transcripciones del gen PgZFP expresadas en las raíces de 4 años de 42 genotipos. (A) La red de coexpresión de las transcripciones del gen 228 PgZFP construidas en P ≤ 5.0E-02. Contiene 228 nodos de transcripción de genes y 4745 bordes de interacción. (B) Los 12 clusters de la red. (C, D) Tendencia de formación de redes en diferentes valores de P: variación en el número de nodos (C) y bordes (D). (E,F) Estadísticas de la tendencia de formación de redes en número de aristas (E) y nodos (F), con 20 replicaciones. “**” indica que la diferencia es significativa en P ≤ 0,01; y "NS" indica que la diferencia no es significativa en P ≤ 0,05. Las transcripciones de genes desconocidos de ginseng seleccionadas al azar se seleccionaron de la base de datos A como controles.

Debido a que el análisis anterior del elemento regulador cis de la familia de genes PgZFP mostró que es probable que los genes de la familia respondan al estrés ambiental, estudiamos más a fondo la familia de genes en respuestas al estrés ambiental, especialmente al estrés salino. El análisis de alineación de secuencias identificó cuatro genes PgZFP que estaban mejor alineados con los genes STZ y AZF que responden a la sal de Arabidopsis, incluidos PgZFP31, PgZFP78-01, PgZFP38 y PgZFP39-01. De los cuatro genes, PgZFP31 se alineó con el genoma del ginseng chino6 y se sometió a un análisis de elementos reguladores cis, lo que muestra su capacidad de respuesta potencial a las hormonas, el estrés ambiental y el crecimiento. Estos cuatro genes PgZFP eran todos del Grupo III del árbol genealógico. Para el experimento se utilizaron raíces adventicias de ginseng. La Figura 7A, B muestra que las raíces adventicias de ginseng eran sensibles al estrés salino (NaCl). Cuando la concentración de sal aumentó a 40 mM, el crecimiento de las raíces de ginseng se inhibió significativamente (Fig. 7A), lo que se indica por raíces más cortas (P ≤ 0,05) (Fig. 7B). Los niveles de expresión relativos de los cuatro genes fueron regulados positivamente por la sal (Fig. 7C). Cuando la concentración de la sal se acercó a los 20 mM de NaCl, las expresiones relativas de dos de los cuatro genes comenzaron a aumentar significativamente. Cuando la concentración de la sal se acercó a 40 mM de NaCl o más, las expresiones relativas de los cuatro genes aumentaron significativamente (P ≤ 0,05) o extremadamente significativamente (P ≤ 0,01), lo que sugiere que al menos cuatro genes de la familia de genes PgZFP están involucrados en Respuesta de las plantas al estrés salino.

Las respuestas de la familia de genes PgZFP al estrés salino. (A) Raíces adventicias de ginseng estresadas con diferentes concentraciones de NaCl en el medio B5 durante 30 días. (B) Variación de la longitud de la raíz lateral de las raíces estresadas por sal. (C) Las expresiones relativas de los genes PgZFP seleccionados de la familia de genes en las raíces estresadas por sal. Las expresiones de los genes en las raíces estresadas con sal se presentaron como el nivel de expresión relativo a la de los genes en las raíces sin estrés salino (0 mM NaCl) considerado como “1”. La prueba t se utilizó para probar la diferencia media de las expresiones genéticas entre las raíces control y estresadas por sal. “*”, significativo a P ≤ 0,05; “**”, significativo a P ≤ 0,01.

Se ha demostrado que la familia de genes C2H2-ZFP en varias especies, incluidas Arabidopsis, arroz, tomate y soja, desempeña funciones importantes en las respuestas de las plantas al estrés abiótico y biótico, el crecimiento y desarrollo de las plantas y la transducción de señales hormonales8,9,10. 11,13,14,15,16. Sin embargo, la familia de genes del ginseng sigue siendo desconocida. Este estudio ha identificado y caracterizado, por primera vez, en todo el genoma, la familia de genes del ginseng. Se identifican y definen genes PgZFP un total de 228 transcripciones del gen C2H2-ZFP, empalmadas alternativamente a partir de 115 genes C2H2-ZFP. Por lo tanto, la familia de genes PgZFP consta de al menos 115 miembros de genes. Este tamaño de la familia de genes del ginseng es comparable con el de la familia de genes del álamo (109)19 y del tomate (99)47, pero es más pequeño que el de la familia de genes de Arabidopsis (176)17, arroz (189) 18, Medicago truncatula (218)20, maíz (211)21 y soja (321)22. Este resultado indica que la familia de genes PgZFP es una familia de genes moderada. Sin embargo, este número de genes PgZFP se identificó en el ginseng chino cv. Damaya. El análisis del pantranscriptoma revela que el número de genes de la familia varía sustancialmente entre los genotipos de P. ginseng, con un pantranscriptoma de 149 genes PgZFP y un transcriptoma central de sólo 12 genes, lo que sugiere que el ginseng tiene un transcriptoma prescindible que varía al menos 137 genes PgZFP.

La familia de genes PgZFP se distribuye en los 24 cromosomas del genoma del ginseng chino, pero sólo 17 (23%) de sus 73 genes PgZFP mapeados son sintéticos con 11 de los genes C2H2-ZFP de Arabidopsis. El análisis de 46 de los 115 genes PgZFP que tienen CDS completo muestra que 40 (87%) de ellos se duplicaron en el período de 18 a 41 millones de años, lo que sugiere que la duplicación de genes juega un papel importante en la expansión de la familia de genes. El análisis de la relación Ka/Ks indica que las selecciones purificadoras y neutrales impulsan la evolución familiar. La actual familia de genes PgZFP se clasifica en cinco grupos junto con los genes C2H2-ZFP de Arabidopsis, lo que sugiere que la familia de genes es una familia de genes antigua que se originó antes de dividirse entre el ginseng y Arabidopsis. Cada grupo de la familia de genes PgZFP tiene motivos conservados específicos que se distinguen de otros grupos; sin embargo, la mayoría de los genes de la familia de genes contienen el motivo QALGGH altamente conservado o su variante, como R/KALGGH. Un estudio anterior demostró que el cambio de cualquier aminoácido en QALGGH puede afectar su capacidad de unión al ADN, y la mutación del aminoácido Q redujo en gran medida su capacidad de unión al ADN48. Los genes C2H2-ZFP que contienen motivos QALGGH e I/D/FLN desempeñaron papeles importantes en la respuesta de las plantas al estrés biótico y abiótico23.

La familia de genes PgZFP se clasificó en 17 subcategorías en el Nivel 2 y se reveló que tiene 53 tipos de elementos reguladores en cis que responden a múltiples procesos biológicos, lo que sugiere que durante el proceso evolutivo se han producido cambios sustanciales en la estructura y las regiones aguas arriba de los genes PgZFP y estos cambios han afectado su diversidad funcional36,37,38. La diversidad funcional de la familia de genes es mayor que la de las familias de genes PgbHLH49, PgNAC50 y PgGRAS51 en ginseng que se clasificaron en 11, 8 y 15 subcategorías, respectivamente. De las 228 transcripciones del gen PgZFP, 134 (59%) tienen funciones de unión. En comparación, el álamo también tiene la mayoría (106) de los genes C2H2-ZFP involucrados en la unión19 y el tomate tiene todos los genes C2H2-ZFP involucrados en la unión, incluida la unión de ácidos nucleares, la unión de compuestos cíclicos orgánicos y la unión de compuestos heterocíclicos47. Esto sugiere que los genes PgZFP desempeñan un papel en la regulación transcripcional al unirse a genes diana posteriores28,29,52.

Los análisis de expresión de la familia de genes PgZFP han dado lugar a varios hallazgos interesantes. En primer lugar, la mayoría de los genes de la familia de genes PgZFP se expresan en un nivel relativamente bajo en un tejido, en una etapa de desarrollo y en la raíz de un genotipo. Los genes PgZFP que se expresaban activamente en un tejido, en una etapa de desarrollo y en la raíz de un genotipo también tendían a expresarse activamente en otros tejidos, en otras etapas de desarrollo y en las raíces de otros genotipos. En segundo lugar, es evidente que las relaciones de expresión de los genes de la familia no son consistentes con sus relaciones filogenéticas determinadas por la similitud de secuencias de aminoácidos, lo que sugiere que los genes que tienen secuencias similares pueden no tener patrones de expresión similares. En tercer lugar, las expresiones de los transcritos empalmados del mismo gen pueden ser sustancialmente diferentes en un tejido, en una etapa de desarrollo y en la raíz de un genotipo. Finalmente, de los 115 genes de la familia de genes PgZFP, las expresiones de sólo unos pocos están coreguladas, mientras que las expresiones de una gran mayoría están reguladas de forma independiente. Sin embargo, es más probable que los genes de la familia de genes PgZFP formen una red de interacción de coexpresión, de la cual algunos desempeñan funciones centrales en la red, lo que indica que los genes miembros de la familia de genes permanecen funcionalmente correlacionados49.

Estudios anteriores demostraron que la familia de genes C2H2-ZFP desempeña funciones importantes en el crecimiento y el desarrollo, y en las respuestas de las plantas a las hormonas y al estrés biótico y abiótico23. El análisis del elemento regulador cis de los genes PgZFP en el presente estudio proporciona otra línea de evidencia sobre estas funciones de los genes en el ginseng. Además, se han identificado cuatro genes de la familia de genes PgZFP, PgZFP31, PgZFP78-01, PgZFP38 y PgZFP39-01, que participaron en la respuesta al estrés salino, lo que sugiere que la familia de genes PgZFP de hecho desempeña funciones en las respuestas de las plantas al estrés abiótico. , particularmente al estrés salino en el ginseng. Curiosamente, los cuatro genes PgZFP pertenecen todos al grupo III del árbol genealógico de genes. De los cuatro genes PgZFP que responden al estrés salino examinados, PgZFP31 y PgZFP78-01 tienen estructuras de dedos de zinc similares a las de STZ, que participa en la respuesta de las plantas al estrés salino en Arabidopsis14. Tanto PgZFP31 como PgZFP78-01 pertenecen a proteínas con dedos de zinc de tipo C1-2i, tienen una gran similitud en el motivo DLN y contienen el motivo FDLNI/L. Se obtuvo un resultado similar para PgZFP38 y PgZFP39-01 en comparación con AZF1 que también participa en la respuesta de la planta al estrés salino en Arabidopsis14,53. Por lo tanto, estos cuatro genes PgZFP proporcionan recursos genéticos para la investigación de la tolerancia a la sal y la mejora genética del ginseng.

La familia de genes PgZFP es una antigua familia de genes que consta de aproximadamente 115 genes PgZFP distribuidos entre los 24 cromosomas del genoma del ginseng. Se originó antes de la división del ginseng de Arabidopsis y sus genes han divergido sustancialmente en secuencias de aminoácidos y funcionalidad, ya que se duplicaron entre 18 y 41 millones de años. Sin embargo, existen motivos conservados entre las supuestas proteínas de los genes de la familia. Los diferentes miembros de genes de la familia de genes se expresan de manera diferente en un tejido, en una etapa de desarrollo y en un genotipo, y la expresión del mismo gen varía según los tejidos, las etapas de desarrollo y los genotipos, lo que indica además una diferenciación de su funcionalidad. Sin embargo, los genes de la familia tienden a expresarse correlativamente, formando una red de coexpresión, lo que sugiere su correlación funcional. Biológicamente, la familia de genes PgZFP desempeña un papel importante en la respuesta de las plantas al estrés salino del ginseng, de donde se identifican cuatro genes PgZFP que participan en la respuesta al estrés salino del ginseng.

Los datos utilizados para este estudio se han depositado en Sequence Read Archive (SRA) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), BioProject PRJNA302556; y en Gene Expression Omnibus (GEO) de NCBI, SRP066368 y SRR13131364-SRR13131405. Los materiales vegetales están disponibles a través de los autores correspondientes, previa solicitud.

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Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Jilin (20210402043GH, 20200801063GH, 20190201264JC, 20190103104JH, 20180414077GH y 20180101027JC) y la Comisión de Desarrollo y Reforma de la provincia de Jilin (2016C06). 4 y 2018C047-3).

Estos autores contribuyeron igualmente: Yue Jiang y Lingyu Liu.

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Agrícola de Jilin, Changchun, 130118, Jilin, China

Yue Jiang, Lingyu Liu, Zhaoxi Pan, Mingzhu Zhao, Lei Zhu, Yilai Han, Li Li, Kangyu Wang, Sizhang Liu, Yi Wang y Meiping Zhang

Centro de investigación de ingeniería de Jilin para el desarrollo y utilización de recursos genéticos de ginseng, Universidad Agrícola de Jilin, Changchun, 130118, Jilin, China

Mingzhu Zhao, Yanfang Wang, Kangyu Wang, Yi Wang y Meiping Zhang

Facultad de Materiales Medicinales Chinos, Universidad Agrícola de Jilin, Changchun, 130118, Jilin, China

Yanfang Wang

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MPZ y YW concibieron y diseñaron el estudio, y MPZ revisó el manuscrito. YJ, LYL, YH, YFW y KW realizaron análisis de datos, y LYL y MZ escribieron el manuscrito. ZP cultivó las raíces adventicias del ginseng. LYL, LZ, LL y SL realizaron estrés salino y realizaron qRT-PCR. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Yi Wang o Meiping Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Jiang, Y., Liu, L., Pan, Z. et al. Análisis de todo el genoma de la familia de genes de la proteína de dedos de zinc C2H2 y su respuesta al estrés salino en el ginseng, Panax ginseng Meyer. Representante científico 12, 10165 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14357-w

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Recibido: 06 de abril de 2022

Aceptado: 06 de junio de 2022

Publicado: 17 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14357-w

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