La manzana C2H2

Horticulture Research volumen 8, número de artículo: 159 (2021) Citar este artículo

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El ácido jasmónico (JA) juega un papel importante en la regulación de la senescencia de las hojas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la senescencia de las hojas del manzano (Malus domestica) siguen siendo difíciles de alcanzar. En este estudio, encontramos que MdZAT10, un factor de transcripción (TF) de dedo de zinc de tipo C2H2 en la manzana, acelera notablemente la senescencia de las hojas y aumenta la expresión de genes relacionados con la senescencia. Para explorar cómo MdZAT10 promueve la senescencia de las hojas, realizamos un cribado por cromatografía líquida/espectrometría de masas. Descubrimos que MdABI5 interactúa físicamente con MdZAT10. MdABI5, un importante regulador positivo de la senescencia de las hojas, aceleró significativamente la senescencia de las hojas en la manzana. Se descubrió que MdZAT10 mejora la actividad transcripcional de MdABI5 para MdNYC1 y MdNYE1, acelerando así la senescencia de las hojas. Además, encontramos que la expresión de MdZAT10 fue inducida por jasmonato de metilo (MeJA), que aceleró la senescencia foliar inducida por JA. También descubrimos que la proteína MdBT2 que responde a JA interactúa directamente con MdZAT10 y reduce la estabilidad de su proteína mediante ubiquitinación y degradación, retrasando así la senescencia de la hoja mediada por MdZAT10. En conjunto, nuestros resultados brindan nueva información sobre los mecanismos por los cuales MdZAT10 regula positivamente la senescencia foliar inducida por JA en manzano.

La senescencia de las hojas de las plantas, la última etapa del desarrollo de las hojas, va acompañada de una serie de cambios fisiológicos y bioquímicos, incluida la degradación de orgánulos intracelulares y la hidrólisis de macromoléculas para la reubicación de nutrientes y energía en tejidos u órganos de almacenamiento de nuevo desarrollo1. Es importante comprender cómo las plantas regulan el proceso de senescencia para evitar pérdidas importantes de rendimiento en la agricultura. El proceso de senescencia de las hojas puede desencadenarse y promoverse por señales ambientales desfavorables, como oscuridad prolongada, sequía y ataque de patógenos2,3,4, y por factores endógenos como la edad, la etapa de desarrollo y las hormonas vegetales5,6. La senescencia de las hojas inhibe la capacidad fotosintética y, por tanto, disminuye la calidad y el rendimiento de los cultivos7,8. Por lo tanto, retrasar la senescencia de las hojas ofrece posibles beneficios económicos7.

Se sabe que las hormonas vegetales afectan el momento de la senescencia de las hojas. Hormonas como el ácido abscísico (ABA), el ácido jasmónico, el etileno (ET) y el ácido salicílico (SA) aceleran el proceso de senescencia de las hojas, mientras que las auxinas, las citoquininas (CK) y el ácido giberélico (GA) retrasan la senescencia de las hojas9. El JA es una fitohormona derivada de lípidos que está omnipresente en el reino vegetal y desempeña funciones esenciales en la regulación de múltiples procesos fisiológicos en las plantas, incluido el crecimiento de las raíces, la senescencia de las hojas y la respuesta a heridas y patógenos10,11,12,13. En Arabidopsis, el contenido de JA endógeno es mayor en las hojas senescentes que en las no senescentes14. De acuerdo con este mayor contenido de JA, varios genes implicados en la vía de biosíntesis de JA, como la LIPOXYGENASA 1/3/4 (LOX1/3/4) y el ÓXIDO DE ALENO CICLASE 1 (AOC1), también están notablemente regulados durante la senescencia de la hoja14. En respuesta a JA, las proteínas JASMONATE ZIM-DOMAIN (JAZ) interactúan con CORONATINE INSENSITIVE1 (COI1), un componente del complejo SCFCOI115,16. Luego, las proteínas JAZ son degradadas por el proteasoma 26S, liberando así genes que responden a JA, como el factor de transcripción bHLH MYC216,17. MYC2 regula positivamente la senescencia foliar inducida por JA activando directamente la expresión del GEN 29 ASOCIADO A LA SENESCENCIA (SAG29), y MYC2 interactúa con los TF bHLH03, 13, 14 y 17 del subgrupo IIId de bHLH, que regulan antagónicamente la senescencia foliar18.

Un gran número de estudios genéticos y transcriptómicos han demostrado que los TF regulan el proceso de senescencia de las hojas10,19. Algunos TF desempeñan funciones críticas en las redes reguladoras de la senescencia de las hojas; Estos TF incluyen miembros de las familias bHLH, NAC, MYB, WRKY, bZIP, dedos de zinc tipo C2H2 y AP2⁄EREBP19,20. Las proteínas con dedos de zinc (ZFP) de tipo C2H2 son una gran familia de reguladores transcripcionales en plantas21. Se sabe que varios TF de dedos de zinc de tipo C2H2 están involucrados en el desarrollo de las plantas y las respuestas al estrés22,23. La mayoría de las ZFP contienen de uno a cuatro motivos QALGGH altamente conservados24. Además, algunas ZFP contienen motivos de represión anfifílica (EAR) asociados a ERF C-terminal, que funcionan como represores transcripcionales25,26. Se encontró que varios miembros de la familia de TF con dedos de zinc de tipo C2H2 estaban regulados hacia arriba o hacia abajo durante la senescencia natural de la hoja19, lo que indica que los TF con dedos de zinc de tipo C2H2 pueden participar en la senescencia de la hoja. La proteína 2 con dedos de zinc de Arabidopsis (AZF2), un TF con dedos de zinc de tipo C2H2, regula positivamente la senescencia de las hojas provocada por la edad27.

INSENSIBLE AL ÁCIDO ABSCÍSICO5 (ABI5), un TF tipo cremallera básica de leucina (bZIP), regula positivamente la señalización de ABA y participa en la germinación de semillas, la tolerancia al estrés abiótico y la senescencia de las hojas4,28,29. Estudios anteriores han revelado que ABI5 modula la senescencia de las hojas mediante regulación transcripcional. ABI5 regula positivamente la senescencia de las hojas inducida por la oscuridad al reprimir directamente la expresión de la proteína de respuesta ABA (ABR)30 y activar la expresión de los genes de degradación de la clorofila NON-YELLOW COLORING1 (NYC1) y STAY-GREEN 1 (SGR1/NYE1)4. Los factores de interacción con fitocromo 4/5 (PIF4/5) de bHLH TF activan directamente ABI5 durante la senescencia inducida por la oscuridad4. En arroz (Oryza sativa), ONAC054 activa directamente OsABI5 en respuesta a la senescencia de las hojas31. Un estudio reciente encontró que MdABI5 está involucrado en la senescencia foliar inducida por ABA32. Estos hallazgos indican que ABI5 desempeña un papel crucial en el proceso de senescencia de las hojas.

Estudios anteriores han identificado varios genes que promueven o retrasan la senescencia de las hojas en la manzana33,34,35. En este estudio, identificamos un TF con dedos de zinc de tipo C2H2, MdZAT10, y demostramos que regula positivamente la senescencia de las hojas en manzanos (Malus domestica). Experimentos adicionales demostraron que MdZAT10 interactúa con MdABI5 y acelera el proceso de senescencia de la hoja mediado por MdABI5. También se descubrió que MdZAT10 acelera la senescencia foliar inducida por JA. Encontramos un regulador JA negativo, MdBT2, que interactúa con MdZAT10 y modula su estabilidad, reprimiendo así la senescencia foliar mediada por MdZAT10. En resumen, utilizamos interacciones proteína-proteína para delinear las relaciones entre MdBT2, MdZAT10 y MdABI5 durante la senescencia de la hoja.

La expresión de un gran número de TF de tipo C2H2 se induce notablemente durante la senescencia natural19. El gen MdZAT10, un TF con dedos de zinc de tipo C2H2 en la subclase C1-2i, es homólogo a Arabidopsis STZ/ZAT10 (DEDO DE ZINC CON TOLERANCIA A LA SAL). El gen MdZAT10 (MDP0000198015) se identificó mediante una búsqueda BLAST en la base de datos del genoma de Apple (Apple Gene Function & Gene Family DataBase versión 1.0). Para identificar proteínas homólogas a ZAT10, se construyó un árbol filogenético que contiene secuencias de 21 especies de plantas diferentes. Todas las proteínas contenían dos dominios de dedos de zinc conservados y un motivo EAR, y MdZAT10 era altamente homólogo a PbZAT10 de Pyrus bretschneideri (Figura complementaria S1).

Medimos el nivel de expresión de MdZAT10 en hojas de manzano en diferentes etapas de desarrollo, incluidas las etapas sin senescencia (NS), senescencia temprana (ES) y senescencia tardía (LS). La expresión de MdZAT10 fue mayor en las etapas ES y LS que en la etapa NS (Fig. 1a). Para confirmar la función de MdZAT10 durante la senescencia de la hoja, se transformó un vector de sobreexpresión de MdZAT10 en Arabidopsis, generando tres líneas de Arabidopsis independientes (MdZAT10-L1, L2 y L3) (Figura complementaria S2). Las hojas desprendidas de plántulas transgénicas de Arabidopsis mostraron un mayor amarillamiento de las hojas que las de plántulas de tipo salvaje (Col) (Fig. 1b). De acuerdo con sus diferencias de color, las hojas de las plantas transgénicas mostraron disminuciones significativas en el contenido de clorofila y el rendimiento cuántico máximo del fotosistema II (Fv/Fm) (Fig. 1c, d). Para confirmar aún más estos fenotipos de senescencia de las hojas, los vectores de sobreexpresión y supresión antisentido de MdZAT10 se transformaron en hojas de manzano separadas utilizando un sistema de expresión transitorio (Figura complementaria S2). Consistentemente, las hojas de manzano que sobreexpresan MdZAT10 exhibieron senescencia temprana, mientras que las hojas de manzano que expresan supresión antisentido de MdZAT10 mostraron senescencia retrasada (Fig. 1e). Además, los vectores de sobreexpresión de MdZAT10 y supresión antisentido de las hojas de manzano también mostraron diferencias correspondientes en el contenido de clorofila (Fig. 1f). Descubrimos que la sobreexpresión de MdZAT10 aumentaba la expresión de MdNYC1 y MdNYE1 en hojas de manzano (Fig. 1g, h). Estos resultados sugieren que MdZAT10 regula positivamente la senescencia de las hojas.

un nivel de transcripción de MdZAT10 en hojas de senescencia tardía (LS), senescente temprana (ES) y no senescentes (NS). b Se incubaron hojas desprendidas de plantas de tipo salvaje (Col) de 3 semanas de edad y tres líneas transgénicas (MdZAT10-L1, L2 y L3) en tampón MES 3 mM en la oscuridad durante 5 días. c Se determinaron el contenido de clorofila y d Fv/Fm antes y después del tratamiento en la oscuridad. e Fenotipo de senescencia de la hoja yf el contenido total de clorofila de las hojas de manzano que expresan transitoriamente el vector vacío (EV), sobreexpresando MdZAT10 o el vector antisentido MdZAT10 en la oscuridad durante 15 días. g, h Los niveles de expresión de MdNYC1 y MdNYE1 en hojas de manzano después de 15 días de tratamiento en oscuridad. Los asteriscos indican diferencias significativas determinadas por la prueba t (*P < 0,05, **P < 0,01)

Para explorar más a fondo el mecanismo por el cual MdZAT10 promueve la senescencia de las hojas, se llevó a cabo un ensayo de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) para detectar proteínas que interactúan con MdZAT10 utilizando MdZAT10-GFP como cebo. Después de la selección, se encontró que la proteína MdABI5 (número de acceso de GenBank: LOC103430245) interactúa con MdZAT10, y se realizó un ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H) para confirmar esta interacción. El ADNc de longitud completa de MdZAT10 se fusionó con el vector pGAD424 como presa (pGAD-MdZAT10), y el ADNc de longitud completa de MdABI5 se fusionó con el vector pGBT9 como cebo (pGBD-MdABI5). Los plásmidos pGAD-MdZAT10 y pGBD-MdABI5 se cotransformaron en levadura. Los resultados mostraron una interacción entre las proteínas MdZAT10 y MdABI5 (Fig. 2a). Para identificar las regiones en MdZAT10 que interactúan con MdAB15, MdZAT10 se dividió en fragmentos N-terminal (MdZAT10-N) y C-terminal (MdZAT10-C). Estos resultados indicaron que los dominios de los dedos de zinc y el motivo EAR de MdZAT10 son esenciales para la interacción entre MdZAT10 y MdABI5 (Fig. 2a). MdZAT10 interactuó con MdABI5, pero no con MdABI1, MdABI2 o MdABI4 (Fig. 2a, b); MdABI5 también interactuó específicamente con MdZAT10 pero no con otros MdZAT (Fig. 2c). Además, llevamos a cabo un ensayo desplegable in vitro y descubrimos que la proteína de fusión MdZAT10-GST podía derribar MdABI5-His (Fig. 2d). Finalmente, en un ensayo BiFC, se observó una fuerte señal de fluorescencia de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en los núcleos solo cuando MdZAT10-cYFP y MdABI5-nYFP se cotransformaron en hojas de Nicotiana benthamiana (Fig. 2e). Estos resultados indicaron que MdZAT10 interactúa físicamente con MdABI5.

a Un ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H) mostró que MdZAT10 interactúa con MdABI5. Se clonaron secuencias de MdZAT10 de longitud completa y de MdZAT10 truncada en el vector pGAD424. Se clonó MdABI5 de longitud completa en el vector pGBT9. El vector pGAD vacío se utilizó como control negativo. b Un ensayo Y2H mostró que MdABI (MdABI1, MdABI2 y MdABI4) y MdZAT10 interactúan. c Un ensayo Y2H mostró que MdABI5 interactúa con las proteínas MdZAT (MdAZF1, MdZAT5, MdZAT6, MdZAT10, MdZAT11, MdZAT14, MdZAT16 y MdZAT18). d Ensayo desplegable in vitro de MdZAT10 y MdABI5. La proteína MdABI5-His se incubó con MdZAT10-GST y GST. Las proteínas derribadas con perlas GST se detectaron utilizando anticuerpos anti-GST y anti-His. e ensayo BiFC. Las construcciones MdZAT10-cYFP y MdABI5-nYFP se expresaron transitoriamente en hojas de Nicotiana benthamiana y la señal de fluorescencia se observó mediante microscopía de fluorescencia. Los núcleos se indican mediante tinción DAPI. Barras de escala, 10 μm

Estudios anteriores han informado que MdABI5 regula la senescencia foliar inducida por ABA32. Detectamos el nivel de expresión de MdABI5 en hojas de manzano en diferentes etapas de desarrollo. El nivel de expresión de MdABI5 fue mayor en las etapas ES y LS que en la etapa NS (Figura complementaria S3). Para dilucidar el papel de ABI5 durante la senescencia de la hoja, se transformó un vector de sobreexpresión de MdABI5 en Arabidopsis, generando tres líneas transgénicas individuales (MdABI5-L1, L2 y L3) (Figura complementaria S2). La sobreexpresión de MdABI5 promovió claramente el amarillamiento de las hojas y redujo el contenido de clorofila y Fv/Fm después de 5 días en la oscuridad (Figura complementaria S3). Además, los vectores de sobreexpresión de MdABI5 y de supresión antisentido de MdABI5 se transformaron transitoriamente en hojas de manzano desprendidas. Las hojas de manzana que sobreexpresaron MdABI5 mostraron un fenotipo de senescencia más grave y un menor contenido de clorofila, mientras que la supresión antisentido de MdABI5 mostró un fenotipo de senescencia retrasada y un mayor contenido de clorofila (Figura complementaria S3). Estudios anteriores han demostrado que ABI5 induce la senescencia de las hojas regulando directamente la expresión de los genes de degradación de la clorofila NYC1 y NYE14,31. En este estudio, la expresión de MdNYC1 y MdNYE1 aumentó en hojas de manzano que sobreexpresan MdABI5 (Figura complementaria S3). Estos resultados sugieren que MdABI5 promueve la senescencia de las hojas.

Dada la interacción entre MdZAT10 y MdABI5, sospechamos que MdZAT10 participa en la senescencia foliar mediada por MdABI5. Se cruzó una línea de Arabidopsis que sobreexpresa MdZAT10 con una línea de Arabidopsis que sobreexpresa MdABI5. Las plantas de Arabidopsis resultantes que sobreexpresaban MdZAT10/MdABI5 se volvieron amarillas mucho más rápido y tenían menos contenido de clorofila que las plantas que sobreexpresaban MdABI5 solo (Fig. 3a, b). De acuerdo con el fenotipo observado en Arabidopsis, la sobreexpresión de MdZAT10 aumentó la senescencia foliar mediada por MdABI5 en hojas de manzano (Fig. 3c, d). Estos resultados revelaron que MdZAT10 acelera la senescencia de las hojas promovida por MdABI5.

a Fenotipo de senescencia de la hoja y b Contenido total de clorofila de hojas desprendidas de Arabidopsis transgénica Col, MdABI5-L2 y MdZAT10-L1/MdABI5-L2 flotaron en tampón MES 3 mM en la oscuridad durante 5 días. c Fenotipo de senescencia de la hoja y d contenido total de clorofila de hojas de manzano que expresan transitoriamente un vector vacío (EV), que sobreexpresan MdABI5 solo o que sobreexpresan MdZAT10 y MdABI5 que se hicieron flotar en tampón MES 3 mM en la oscuridad durante 14 días. e, f Los niveles de expresión de MdNYC1 y MdNYE1 en callos de tipo salvaje (WT) y callos transgénicos MdABI5-OX, MdZAT10-OX, MdZAT10-OX/MdABI5-OX se midieron mediante ensayo qRT-PCR. g Diagrama esquemático de construcciones informadoras y efectoras. h, i Un ensayo de luciferasa mostró que la cotransformación transitoria de MdZAT10 y MdABI5 en hojas de tabaco activó la expresión de MdNYC1 y MdNYE1. El vector vacío (SK + LUC) sirvió como control negativo. La relación LUC/REN representa la capacidad de MdABI5 para activar la expresión de MdNYC1 y MdNYE1. Los asteriscos indican diferencias significativas en *P < 0,05, **P < 0,01

Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que MdZAT10 afecta la activación transcripcional de MdNYC1 y MdNYE1 por MdABI5. Para confirmar esta hipótesis, se detectó la expresión genética en los callos de plantas de manzana transgénicas que sobreexpresan MdABI5 (MdABI5-OX) (Figura complementaria S2). Descubrimos que la expresión de MdNYC1 y MdNYE1 estaba dramáticamente aumentada en los callos MdABI5-OX. El vector de sobreexpresión MdZAT10 se introdujo en callos transgénicos que sobreexpresan MdABI5, y los callos transgénicos MdZAT10-OX/MdABI5-OX resultantes mostraron una expresión de MdNYC1 y MdNYE1 notablemente aumentada (Fig. 3e, f). Para confirmar este resultado, realizamos un ensayo de expresión transitoria en hojas de tabaco. Los fragmentos promotores de MdNYC1 y MdNYE1 se fusionaron en el indicador pGreenII 0800-LUC (pMdNYC1-LUC, pMdNYE1-LUC), y MdZAT10 y MdABI5 se fusionaron en la construcción efectora pGreenII 62-SK (MdZAT10-SK, MdABI5-SK). Descubrimos que MdABI5 activó los promotores de MdNYC1 y MdNYE1 y tuvo un efecto más fuerte cuando se cotransformaron MdZAT10 y MdABI5 (Fig. 3g-i). Estos resultados indicaron que la interacción entre MdZAT10 y MdABI5 mejora la actividad transcripcional de MdABI5 para MdNYC1 y MdNYE1.

También encontramos que MdZAT10 fue inducido por MeJA (Fig. 4a). Para confirmar aún más la función de MdZAT10 en respuesta a JA, produjimos callos de manzana transgénicos que expresaban β-glucuronidasa (GUS) impulsada por una región 2 kb aguas arriba del gen MdZAT10. La tinción histoquímica mostró que el tratamiento con MeJA aumentó significativamente la actividad de GUS (Fig. 4b, c). Las hojas desprendidas de Arabidopsis transgénica MdZAT10 mostraron un mayor amarillamiento de las hojas con el tratamiento con MeJA (Fig. 4d). El contenido de clorofila en estas hojas se redujo significativamente en comparación con las hojas de las plantas Col (Fig. 4e). Consistentemente, tras el tratamiento con MeJA, las hojas de manzano que sobreexpresaban MdZAT10 también exhibieron senescencia temprana, mientras que la supresión antisentido de MdZAT10 mostró senescencia retrasada (Fig. 4f). Además, la sobreexpresión de MdZAT10 en las hojas y la supresión antisentido de MdZAT10 mostraron diferentes contenidos de clorofila (Fig. 4g). Estos resultados indicaron que MdZAT10 actúa como un regulador positivo de la senescencia foliar inducida por JA en manzano.

a Nivel de transcripción de MdZAT10 en respuesta a MeJA 100 μM. b Tinción de GUS y c Actividad de GUS en callos transgénicos proMdZAT10::GUS con (MeJA) o sin tratamiento (simulado) de MeJA 100 µM durante 12 h. d Fenotipo de senescencia de la hoja y contenido de clorofila de hojas desprendidas de Col de 3 semanas de edad y Arabidopsis MdZAT10-L1, L2 y L3 transgénicas flotaron en tampón MES 3 mM con o sin MeJA 100 μM durante 3 días. f Fenotipo de senescencia de la hoja y g contenido de clorofila de hojas de manzano que expresan transitoriamente el vector vacío (EV), que sobreexpresa el vector antisentido MdZAT10 o MdZAT10 flotado en tampón MES 3 mM con o sin MeJA 100 μM durante 14 días. Los asteriscos indican diferencias significativas según la prueba t (*P < 0,05, **P < 0,01)

Además de su regulación transcripcional, encontramos que MdZAT10 estaba regulado a nivel postraduccional en respuesta al tratamiento con MeJA. Se realizó un ensayo de degradación de proteínas in vitro para medir el nivel de proteína de MdZAT10 en respuesta al tratamiento con MeJA. La proteína de fusión MdZAT10-His se incubó con proteína total de callos de manzana con o sin tratamiento con MeJA. El nivel de MdZAT10-His disminuyó rápidamente sin tratamiento con MeJA, pero la caída en el nivel de proteína MdZAT10 fue notablemente anulada por el tratamiento con MeJA o el inhibidor del proteasoma 26S MG132 (Figura complementaria S4a). Además, el nivel de proteína MdZAT10 en los callos de manzana transgénicos que sobreexpresan MdZAT10 aumentó con el tratamiento con MeJA (Figura complementaria S4b). Estos resultados indicaron que la presencia de MeJA redujo la degradación de la proteína MdZAT10 por la vía del proteosoma 26S.

Además de MdABI5, se seleccionó MdBT2 como una proteína de interacción potencial de MdZAT10. MdBT2 juega un papel clave en la regulación de la senescencia foliar mediada por JA36. Utilizamos un ensayo Y2H para determinar si interactúan MdBT2 y MdZAT10. El ADNc de longitud completa de MdBT2 se fusionó con el vector pGBT9 como cebo (pGBD-MdBT2). Sólo las células de levadura que contenían pGAD-MdZAT10 y pGBD-MdBT2 crecieron bien en el medio de detección -Trp/-Leu/-His/-Ade (Fig. 5a). Para determinar las regiones de MdBT2 que interactúan con MdZAT10, MdBT2 se dividió en fragmentos N-terminal (MdBT2-N) y C-terminal (MdBT2-C). Como se muestra en la Fig. 5b, los dominios BTB y TAZ de MdBT2 fueron indispensables para esta interacción (Fig. 5b). Para determinar si MdBT2 interactúa específicamente con MdZAT10, se fusionaron siete ZFP de tipo C2H2 de manzana (MdAZF1, MdZAT5, MdZAT6, MdZAT11, MdZAT14, MdZAT16 y MdZAT18) al vector presa pGAD424. Sin embargo, ninguno de ellos logró interactuar con MdBT2 (Figura complementaria S5). MdBT1, MdBT2, MdBT3.1 y MdBT4 son miembros importantes de la familia de proteínas MdBT de manzana, y MdBT1 y MdBT2 interactúan con MdZAT10 (Figura complementaria S5).

a, b Un ensayo Y2H mostró la interacción entre MdZAT10 y MdBT2. Se clonaron secuencias MdZAT10 y MdBT2 de longitud completa y truncadas en los vectores pGBD y pGAD. c Ensayo desplegable in vitro con MdZAT10 y MdBT2. La proteína MdZAT10-His se incubó con GST-MdBT2 y GST. Las proteínas que se eliminaron con perlas GST se detectaron utilizando anticuerpos anti-GST y anti-His. d Ensayo BiFC. Las construcciones MdZAT10-cYFP y MdBT2-nYFP se expresaron transitoriamente en hojas de Nicotiana benthamiana y la señal de fluorescencia en el núcleo se observó mediante microscopía de fluorescencia. Los núcleos se indican mediante tinción DAPI. Barras de escala, 10 μm

La interacción MdBT2-MdZAT10 se verificó además mediante ensayos desplegables y BiFC. Para el ensayo desplegable, se incubaron la proteína de fusión MdBT2-GST y GST como control con la proteína de fusión MdZAT10-His. Solo MdBT2-GST pudo derribar MdZAT10-His (Fig. 5c). A continuación, realizamos un ensayo BiFC para confirmar aún más la interacción. MdZAT10 y MdBT2 se fusionaron con las regiones C-terminal (cYFP) y N-terminal (nYFP) de la proteína fluorescente amarilla, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 5d, se detectó una fuerte señal de fluorescencia en el núcleo cuando se inyectaron MdZAT10-cYFP y MdBT2-nYFP en hojas de N. benthamiana, mientras que no se detectó ninguna señal de fluorescencia de YFP en los controles negativos. En conjunto, estos resultados sugirieron que MdBT2 interactúa físicamente con MdZAT10.

Estudios recientes han demostrado que MdBT2 generalmente regula negativamente la estabilidad de sus proteínas diana mediante ubiquitinación37,38. Incubamos la proteína de fusión MdZAT10-His con proteína total de callos de manzana tratados con o sin el inhibidor del proteasoma MG132. La estabilidad de la proteína de MdZAT10 fue mejorada por MG132, lo que indica que la proteína MdZAT10 se degrada por la vía del proteosoma 26S (Figura complementaria S4).

Luego, especulamos que MdBT2 media la estabilidad de la proteína MdZAT10. Para confirmar esta especulación, generamos callos de manzana transgénicos que sobreexpresan MdBT2 y antisentido (MdBT2-OX y MdBT2-Anti). Se realizó un ensayo de degradación de MdZAT10 libre de células incubando MdZAT10-His con proteína total extraída de callos de tipo salvaje, MdBT2-OX y MdBT2-Anti. Como se muestra en la Fig. 6a, la degradación de la proteína MdZAT10-His fue mucho más rápida en los callos MdBT2-OX que en los callos de tipo salvaje, mientras que MdZAT10-His se degradó más lentamente en los callos MdBT2-Anti. Sin embargo, el inhibidor del proteasoma MG132 reprimió notablemente la degradación de la proteína MdZAT10-His (Fig. 6a). Estos resultados indicaron que la proteína MdZAT10 se degrada mediante la vía del proteosoma 26S y se realizó un ensayo de ubiquitinación para verificar aún más este hallazgo. La proteína total extraída de los callos MdBT2-GFP y GFP se incubó con la proteína MdZAT10-His. La proteína MdZAT10-His ubiquitinada se evaluó utilizando anticuerpos anti-His y anti-Ubi. Se detectó una mayor cantidad de MdZAT10-His de alta masa molecular en la mezcla MdBT2-GFP + MdZAT10-His (Fig. 6b). Para confirmar que MdBT2 promueve la degradación de MdZAT10 in vivo, generamos callos de manzana transgénicos 35S::MdZAT10-GFP y 35S::MdZAT10-GFP + 35S::MdBT2-OX. La transferencia Western se realizó con un anticuerpo anti-GFP, y la abundancia de la proteína MdZAT10-GFP fue menor en los callos transgénicos 35S::MdZAT10-GFP + 35S::MdBT2-OX (Fig. 6c). En conjunto, estos resultados demostraron que MdBT2 media la degradación de la proteína MdZAT10.

a Ensayo de degradación de MdZAT10-His libre de células. La proteína de fusión MdZAT10-His se incubó con proteína total extraída de callos transgénicos de tipo salvaje (WT), MdBT2-OX y MdBT2-Anti durante los períodos de tiempo indicados. b MdBT2 ubiquitinó la proteína MdZAT10-His in vivo. MdZAT10-His se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo anti-His y luego se examinó utilizando anticuerpos anti-His y anti-Ubi. IP, inmunoprecipitado; IB, inmunotransferencia; Ubi, ubiquitina. c La abundancia de la proteína MdZAT10-GFP en callos de manzana transgénicos (MdZAT10-GFP y MdZAT10-GFP/MdBT2-OX) se evaluó mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-GFP.

Estudios anteriores han revelado que MdBT2 retrasa la senescencia foliar inducida por JA36. Dado que MdBT2 promovió la ubiquitinación de MdZAT10, especulamos que MdBT2 está involucrado en la regulación de la senescencia foliar promovida por MdZAT10. Para investigar la función potencial de MdBT2 en la senescencia de las hojas, obtuvimos tres líneas transgénicas de Arabidopsis (MdBT2-L1, L2 y L3) y plantas de manzana transgénicas que sobreexpresan BT2 (MdBT2-OE-L1 y MdBT2-OE-L5) y BT2 antisentido ( MdBT2-Anti-L13 y MdBT2-Anti-L23) (Figura complementaria S2). Las hojas que sobreexpresan MdBT2 tanto de Arabidopsis como de manzano mostraron un fenotipo de senescencia retardada, mientras que las plantas antisentido de MdBT2 mostraron senescencia foliar acelerada inducida por JA. El contenido de clorofila fue consistente con el fenotipo (Fig. 7a, by Fig. Suplementaria S6). La línea de Arabidopsis que sobreexpresa MdZAT10 se cruzó con la línea de Arabidopsis que sobreexpresa MdBT2. Las plantas de Arabidopsis resultantes que sobreexpresan MdZAT10 / MdBT2 mostraron una senescencia foliar retrasada y un mayor contenido de clorofila en comparación con las plantas que sobreexpresan MdZAT10 (Fig. 7c, d). De acuerdo con estos resultados, la sobreexpresión de MdBT2 disminuyó el fenotipo de senescencia foliar promovido por MdZAT10 en hojas de manzano y aumentó el contenido de clorofila (Fig. 7e, f). En conjunto, estos resultados indicaron que MdBT2 retrasó la senescencia foliar promovida por MdZAT10.

a Fenotipo de senescencia de la hoja y b Contenido de clorofila de hojas desprendidas de plántulas de manzanos de tipo silvestre (GL-3) y transgénicas que sobreexpresan MdBT2 (MdBT2-OE-L1, MdBT2-OE-L5) y MdBT2 antisentido (MdBT2-Anti-L13, MdBT2 -Anti-L23) que se hicieron flotar en tampón MES 3 mM con MeJA 100 μM en la oscuridad durante 12 días. c Fenotipo de senescencia de la hoja y d contenido de clorofila de hojas desprendidas de Col y Arabidopsis MdZAT10-L1, MdZAT10-L1/MdBT2-L1 y MdZAT10-L1/MdBT2-L2 transgénicas que se hicieron flotar en tampón MES 3 mM en la oscuridad durante 6 días . El fenotipo de senescencia de la hoja y el contenido de clorofila de las hojas de manzano que expresan transitoriamente el vector vacío (EV) o que sobreexpresan MdZAT10 solo o MdZAT10 y MdBT2 se hicieron flotar en tampón MES 3 mM en la oscuridad durante 13 días. Los asteriscos indican diferencias significativas en *P < 0,05, **P < 0,01

La senescencia de las hojas es un proceso complejo que implica la degradación de componentes celulares como los cloroplastos39. Acompañado de la degradación de cantidades masivas de clorofila, la característica más visible de la senescencia de las plantas es el amarillamiento de las hojas. La senescencia de las hojas también afecta la productividad de los cultivos y la aptitud de las plantas40. Muchos TF muestran cambios de expresión durante la senescencia de las hojas41. En este estudio, identificamos un TF con dedos de zinc de tipo C2H2, MdZAT10, que regula positivamente la senescencia de las hojas inducida por la oscuridad y el JA.

STZ/ZAT10 es un miembro de la familia TF de dedos de zinc de tipo C2H2 en la subclase C1-2i que participa en diferentes estreses abióticos como sequía, salinidad, frío y estrés osmótico42,43,44,45,46. Además, desempeña un papel central en el crecimiento y desarrollo de las plantas47. Estudios anteriores demostraron que se inducen varios TF con dedos de zinc de tipo C2H2 durante la senescencia en Arabidopsis19,41. AZF2 funciona como un regulador positivo de la senescencia foliar dependiente de la edad, y la pérdida de la función AZF2 retrasó la senescencia foliar27. Nuestros resultados mostraron que la expresión de MdZAT10 es mayor en hojas senescentes que en hojas jóvenes (Fig. 1), y la sobreexpresión de MdZAT10 aceleró la senescencia de las hojas (Fig. 1). Exploramos más a fondo cómo MdZAT10 promueve la senescencia de las hojas y medimos los niveles de expresión de algunos genes relacionados con la senescencia. Los callos transgénicos MdZAT10-OX mostraron una expresión significativamente mejorada de los genes relacionados con la senescencia MdSAG29 y MdPAO y regularon negativamente la expresión de MdWRKY70 y MdAPX2 (Figura complementaria S7). La sobreexpresión de SAG29 en Arabidopsis aceleró la senescencia de las hojas48. SAG29 actúa como gen diana de MYC2 y participa en la senescencia foliar inducida por JA18. La feoforbida a oxigenasa (PAO) es inducida por senescencia natural, y el mutante pao1 exhibe un fenotipo verde49. En Arabidopsis, WRKY70 regula negativamente la senescencia de las hojas dependiente de la edad50. APX2 (ASCORBATO PEROXIDASA2) codifica APX2 citosólico, que desempeña un papel clave en la eliminación de H2O251. El H2O2 es el inductor de senescencia foliar más comúnmente utilizado52. Se ha informado que los niveles elevados de especies reactivas de oxígeno (ROS) aceleran la senescencia de las hojas53,54,55. Es posible que MdZAT10 promueva la senescencia de las hojas al reducir la eliminación de ROS o regular la expresión de genes relacionados con la senescencia.

Además, encontramos que MdZAT10 promueve la senescencia foliar inducida por JA. MdZAT10 se indujo con tratamiento con MeJA, y los callos transgénicos MdZAT10-OX mostraron una expresión mejorada de MdAOC1 y MdAOS (ÓXIDO ALENO SINTASA) (Figura complementaria S7). AOC1 y AOS están asociados con la vía de biosíntesis de JA y su expresión aumenta durante la senescencia de la hoja10. En Arabidopsis, MYC2 se une al promotor de STZ/ZAT10 y regula su expresión56. STZ/ZAT10 y AZF2 pueden unirse al promotor LOX3 para regular la respuesta temprana a MeJA57. Estos resultados indican que STZ/ZAT10 está involucrado en la señalización de JA.

Además de regular genes posteriores, MdZAT10 puede regular la senescencia de las hojas al interactuar con otras proteínas. Aquí, demostramos que MdZAT10 interactúa con MdABI5 (Fig. 2). ABI5 regula la senescencia foliar inducida por la oscuridad y ABA4,30,32,58. Estudios recientes han indicado que ABI5 regula negativamente la fotosíntesis y el desarrollo de cloroplastos bajo tratamiento oscuro4,58. Los datos de RNA-seq mostraron que StABI5 regula negativamente el nivel de expresión de genes relacionados con la fotosíntesis58. ABI5 regula positivamente la senescencia de las hojas al reprimir directamente la expresión de ABR30 y activar la expresión de NYC1 y NYE14,31,58. Aquí, nuestros datos mostraron que las plantas transgénicas que sobreexpresan MdABI5 mostraron una mayor senescencia de las hojas y que la supresión antisentido de MdABI5 retrasó la senescencia de las hojas (Figura complementaria S3). MdABI5 activó la expresión de MdNYC1 y MdNYE1 en callos de manzana transgénicos MdABI5-OX, lo que confirma aún más la regulación positiva de la senescencia de las hojas por MdAB15 (Fig. 3). Descubrimos que MdZAT10 aceleró la senescencia de la hoja mediada por MdABI5 y aumentó la activación transcripcional de MdNYC1 y MdNYE1 por MdABI5 (Fig. 3). Es posible que MdZAT10 promueva la senescencia de las hojas al interactuar con MdABI5 para afectar la actividad transcripcional de MdABI5 para los genes diana.

Además de MdABI5, MdZAT10 también interactúa con MdBT2. MdBT2 retrasó la senescencia de las hojas inducida por JA y MdBT2 retrasó la senescencia de las hojas promovida por MdZAT10 (Fig. 7). Estos resultados indicaron que MdBT2 desempeña un papel opuesto en la senescencia foliar promovida por MdZAT10. La ubiquitinación está ampliamente involucrada en los procesos biológicos de las plantas20. Varios estudios han demostrado la implicación de algunas ligasas E3 en la senescencia de las hojas a través de la vía del proteosoma 26S59. Un estudio reciente reveló que MdBT2 interactúa con MdMYC2 y MdJAZ2, regulando así la senescencia foliar inducida por JA36. BT2 es un componente del complejo CRL3 que promueve la ubiquitinación de la proteína diana60. Nuestros resultados mostraron que MdBT2 promovió la degradación de MdZAT10 y retrasó la senescencia foliar inducida por JA (Figs. 5-7). En presencia de JA, se promovió la degradación de MdBT236, liberando así MdZAT10 de la degradación mediada por MdBT2. Nuestros resultados proporcionan información sobre los mecanismos moleculares mediante los cuales BT2 media la senescencia foliar inducida por JA. Estos resultados implican que MdBT2 regula dinámicamente la senescencia foliar inducida por JA mediante la regulación de diferentes proteínas diana. Aunque MdZAT10 interactúa con MdBT2 y MdABI5, no está claro si estas dos interacciones están relacionadas. La misma región de MdZAT10 interactúa con MdBT2 y MdABI5, y tanto MdBT2 como MdABI5 interactúan con MdZAT10 de longitud completa (Figs. 2 y 5). Es posible que MdBT2 y MdABI5 interactúen competitivamente con MdZAT10 para regular antagónicamente la senescencia de las hojas, pero esta hipótesis requiere una mayor verificación.

En resumen, se propone un modelo de trabajo para resumir el papel de MdZAT10 en la senescencia de las hojas (Fig. 8). Por un lado, MdZAT10 regula positivamente la senescencia de la hoja a través de su interacción con MdABI5, mejorando la actividad transcripcional de MdABI5 para los genes de degradación de clorofila MdNYC1 y MdNYE1. Por otro lado, en ausencia de MeJA, MdBT2 interactúa con MdZAT10 y ubiquitina MdZAT10 para degradar MdZAT10, regulando así negativamente la senescencia foliar promovida por MdZAT10. Por el contrario, MdZAT10 es inducido por MeJA exógeno, que promueve la senescencia de las hojas. MeJA acelera la degradación de MdBT2, liberando MdZAT10, que contribuye a la senescencia foliar inducida por JA. En este estudio, hemos caracterizado el papel de MdZAT10 en la red reguladora de la senescencia foliar a través de su interacción directa con MdBT2 y MdABI5.

Por un lado, MdZAT10 regula positivamente la senescencia de las hojas al interactuar con MdABI5, mejorando la actividad transcripcional de MdABI5 para MdNYC1 y MdNYE1. Por otro lado, en ausencia de JA, MdBT2 interactúa con MdZAT10 y ubiquitina MdZAT10 para degradar MdZAT10, regulando así negativamente la senescencia foliar promovida por MdZAT10. En la actualidad, el JA acelera la degradación de MdBT2, liberando MdZAT10, que contribuye a la senescencia foliar inducida por el JA.

En este estudio se utilizaron cultivos de tejidos de manzana (Malus × domestica 'GL-3'). Las plántulas de manzana se subcultivaron en medio MS suplementado con 0,6 mg L-1 6-BA, 0,2 mg L-1 GA y 0,2 mg L-1 NAA en condiciones de día largo (25 °C, 16/8 h de luz/oscuridad). ) y subcultivados a intervalos de 30 días. En este estudio también se utilizaron callos de manzana 'Orin' (Malus domestica Borkh.). Los callos se cultivaron en medio MS suplementado con 1,5 mg L-1 2,4-D y 0,4 mg L-1 6-BA a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se subcultivaron a intervalos de 15 días. Los callos de manzana se utilizaron para la transformación genética. Las plántulas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia se cultivaron a 22 °C en condiciones de día largo (16/8 h de luz/oscuridad). Se utilizaron plántulas de Arabidopsis para la transformación genética y la identificación funcional.

Para construir vectores de sobreexpresión, las secuencias codificantes de longitud completa de MdBT2 y MdABI5 se clonaron en el vector pCXCN-Myc, y la secuencia codificante de longitud completa MdZAT10 se clonó en el vector pRI-101 (con una etiqueta GFP). Para generar vectores de supresión antisentido (MdBT2-Anti, MdABI5-Anti y MdZAT10-Anti), se clonaron fragmentos de las secuencias MdBT2, MdABI5 y MdZAT10 en el vector pRI-101. Los callos de manzana transgénicos MdBT2-GFP se obtuvieron como se describe en nuestro estudio anterior38. Para generar la construcción proMdZAT10:GUS, el fragmento promotor de MdZAT10 se insertó en el vector pCAMBIA1300-GUS, que luego se transformó en callos de manzana. Se obtuvieron plántulas de manzana transgénicas, callos de manzana y Arabidopsis de acuerdo con los métodos descritos previamente61,62. Las hojas de manzano de transformación transitoria se obtuvieron según un método descrito previamente62. Todos los cebadores utilizados para la clonación de genes se enumeran en la Tabla complementaria 1.

El ARN total se aisló de plántulas de manzano, callos de manzana, plántulas de Arabidopsis y plántulas tratadas utilizando el kit RNAplant Plus (TIANGEN) según el protocolo del fabricante. El ADNc de la primera cadena se sintetizó utilizando el kit de reactivos PrimeScript™ RT (TaKaRa) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. qRT-PCR se realizó en un instrumento StepOnePlus (Applied Biosystems) utilizando UltraSYBR Mixture (Takara). Todos los cebadores se enumeran en la Tabla complementaria 2. Se realizaron tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas para cada experimento.

Se realizó un ensayo LC/MS con la proteína MdZAT10-GFP para descartar las proteínas que interactúan con MdZAT10 como se describió anteriormente63. La proteína MdZAT10-GFP se extrajo de callos transgénicos que sobreexpresan MdZAT10 y se purificó utilizando un kit Pierce Classic IP (Thermo Fisher). La proteína MdZAT10-GFP se incubó con proteína total extraída de plántulas de manzana durante 6 h. Las soluciones de proteínas mixtas se incubaron con perlas de agarosa de proteína A/G y anticuerpo anti-GFP de acuerdo con un protocolo estándar de coinmunoprecipitación. Luego, se eluyó la resina y las proteínas eluidas se separaron en geles SDS-PAGE. La identificación de proteínas se llevó a cabo mediante LC-MS/MS (OE Biotech, Shanghai, China).

Para confirmar las interacciones entre MdZAT10 y MdABI5, y MdBT2 y MdZAT10, las secuencias codificantes de MdZAT10, MdABI5 y MdBT2 se clonaron en los vectores pGAD424 y pGBT9 para formar pGAD-MdZAT10, pGBD-MdABI5 y pGBD-MdBT2. Se clonaron secuencias de MdZAT10 truncadas (aminoácidos 1–207 y 191–270) en pGAD424. Las secuencias truncadas de MdBT2 también se clonaron en pGBT937. Realizamos un ensayo Y2H como se describió anteriormente64. Los plásmidos pGBD-MdABI5 y pGBD-MdBT2 se transformaron individualmente con pGAD-MdZAT10 en la cepa de levadura Y2H Gold (Clontech). Los transformantes de levadura se cultivaron en medio SD base/-Leu/-Trp y luego se transfirieron a medio SD base/-Leu/-Trp/-His/-Ade para las interacciones.

Las secuencias codificantes de longitud completa de MdZAT10, MdBT2 y MdABI5 se clonaron en los vectores pET32a y pGEX4T-1 para generar las construcciones recombinantes MdZAT10-pET32a, MdZAT10-pGEX 4T-1, MdABI5-pET32a y MdBT2-pGEX 4T-1. . Las construcciones se introdujeron en Escherichia coli BL21 (DE3), después de lo cual se generaron las proteínas de fusión MdZAT10-His, MdZAT10-GST, MdABI5-His y MdBT2-GST mediante inducción con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG). ). Las proteínas eluidas se detectaron mediante transferencia Western con anticuerpos anti-GST y anti-His (Abmart, Shanghai, China).

Las secuencias codificantes de MdZAT10, MdBT2 y MdABI5 se clonaron en los vectores 35S::pSPYCE-cYFP y 35S::pSPYNE-nYFP para generar MdZAT10-cYFP, MdBT2-nYFP y MdABI5-nYFP. Las construcciones recombinantes se transformaron en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 y luego se inyectaron en hojas de N. benthamiana. Las señales de fluorescencia de YFP se detectaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (Zeiss).

Para examinar el fenotipo de senescencia de las hojas, las hojas desprendidas se colocaron en tampón MES 3 mM (pH 5,8) en la oscuridad a 22 °C. Para examinar la senescencia de las hojas inducida por fitohormonas, las hojas desprendidas se hicieron flotar en tampón MES 3 mM (pH 5,8) que contenía MeJA 100 μM a 22 °C y se mantuvieron bajo luz tenue durante el período de tiempo indicado.

Para medir la concentración total de clorofila, se extrajeron los pigmentos totales de las hojas de las plantas con etanol al 95% (v/v) durante 24 h. La absorbancia a 649 y 665 nm se midió utilizando un espectrofotómetro ultravioleta/visible (SOPTOP UV2800S, Shanghai, China). Para calcular las proporciones Fv/Fm, las hojas se analizaron con un sistema cerrado de imágenes de fluorescencia de clorofila (Photon System Instruments, Brno, República Checa) de acuerdo con las instrucciones del fabricante como se describió anteriormente31.

Para el ensayo de degradación de proteínas in vitro, la proteína total se extrajo de callos de manzana transgénicos y de tipo salvaje utilizando un tampón de degradación (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 4 mM, DTT 5 mM, y ATP 10 mM). Los extractos de proteínas se incubaron con MdZAT10-His a 22 °C y se evaluaron mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-His (Abmart).

Realizamos un ensayo de ubiquitinación in vivo como se describió anteriormente64. En resumen, los callos transgénicos MdBT2-GFP se extrajeron utilizando un kit PierceTM Classic IP (Thermo Fisher) y los extractos se incubaron con la proteína MdZAT10-His a 4 °C durante la noche. La ubiquitinación in vivo de MdZAT10 se detectó mediante transferencia Western con anticuerpos anti-His (Abmart) y anti-Ubi (Sigma-Aldrich).

Para llevar a cabo el ensayo de expresión transitoria, las secuencias promotoras MdNYC1 y MdNYE1 se insertaron en el vector pGreenII 0800-LUC. Se clonaron MdZAT10 y MdABI5 de longitud completa en el vector pGreen 62-SK. Los plásmidos recombinantes se transformaron en hojas de N. benthamiana mediante transformación mediada por Agrobacterium, y la relación de actividad LUC/REN se detectó utilizando un sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega)64.

Para la tinción con GUS, las plantas transgénicas se incubaron en tampón X-gluc (X-Gluc 1 mM, ferricianuro 0,5 mM, ferrocianuro 0,5 mM, EDTA 0,1 mM y Triton X-100 al 0,1%) a 37 °C durante 12 h. La actividad de GUS se detectó utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia.

Cada experimento en este estudio se repitió al menos tres veces. Los datos se analizaron mediante la prueba t utilizando el software GraphPad Prism 6.02 y los asteriscos indican diferencias significativas (*P <0,05, **P <0,01).

Los datos de secuencia de este artículo se pueden encontrar en el genoma de Apple (RDA): MdABI5 (LOC103430245), MdABI1 (MDP0000265371), MdABI2 (MD15G1054500), MdABI4 (MD01G1155400), MdBT1 (MDP0000151000), MdBT2 (MDP00006). 43281), MdBT3.1 ( MDP0000296225), MdBT4 (MDP0000215415), MdNYE1, (MDP0000322543), MdNYC1 (MDP0000124013), MdAZF1 (MDP0000265345), MdZAT5 (MDP0000769354), MdZAT6 (MDP000031) 9225), MdZAT10 (MDP0000198015), MdZAT11 (MDP0000305944), MdZAT14 (MDP0000204390), MdZAT16 (MDP0000137826) y MdZAT18 (MDP0000768369).

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Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31772288) y la Fundación de Investigación Básica Principal de Ciencias Naturales de Shandong (ZR2020ZD43).

Laboratorio Nacional Clave de Biología de Cultivos, Centro de Innovación Colaborativa de Calidad de Frutas y Verduras y Producción Eficiente de Shandong, Facultad de Ciencias e Ingeniería de Horticultura, Universidad Agrícola de Shandong, Tai-An, Shandong, 271018, China

Kuo Yang, Jian-Ping An, Xue-Na Shen, Ya-Jing Liu, Da-Ru Wang, Xing-Long Ji, Yu-Jin Hao y Chun-Xiang You

Laboratorio Nacional Clave de Biología de Cultivos, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Agrícola de Shandong, Tai-An, Shandong, 271018, China

Chong-Yang Li

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JA propuso el proyecto. KY realizó la mayoría de los experimentos y escribió el manuscrito. XS, DW y CL construyeron los vectores. YL y XJ proporcionaron los materiales vegetales y la metodología de ensayo. YH y CY discutieron el artículo. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito.

Correspondencia a Yu-Jin Hao o Chun-Xiang You.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Yang, K., An, JP., Li, CY. et al. El factor de transcripción de dedos de zinc tipo C2H2 de manzana, MdZAT10, regula positivamente la senescencia foliar inducida por JA al interactuar con MdBT2. Hortic Res 8, 159 (2021). https://doi.org/10.1038/s41438-021-00593-0

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Recibido: 01 de febrero de 2021

Revisado: 15 de abril de 2021

Aceptado: 26 de abril de 2021

Publicado: 01 de julio de 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41438-021-00593-0

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