El análisis comparativo del transcriptoma de Veratrum maackii y Veratrum nigrum revela múltiples genes candidatos implicados en la biosíntesis de alcaloides esteroides | Grupo Co., Ltd del gas a granel de Huizhou

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 8198 (2023) Citar este artículo

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Veratrum (Melanthiaceae; Liliales) es un género de hierbas perennes conocidas por la producción de alcaloides esteroides bioactivos únicos. Sin embargo, la biosíntesis de estos compuestos no se comprende completamente porque muchos de los pasos enzimáticos posteriores aún no se han resuelto. RNA-Seq es un método potente que se puede utilizar para identificar genes candidatos implicados en vías metabólicas comparando los transcriptomas de tejidos metabólicamente activos con controles que carecen de la vía de interés. Se secuenciaron los transcriptomas de raíces y hojas de plantas silvestres de Veratrum maackii y Veratrum nigrum y se ensamblaron 437.820 lecturas limpias en 203.912 unigenes, de las cuales el 47,67% estaban anotadas. Identificamos 235 unigenes expresados diferencialmente potencialmente involucrados en la síntesis de alcaloides esteroides. Se seleccionaron veinte unigenes, incluidos nuevos candidatos a monooxigenasas del citocromo P450 y factores de transcripción, para su validación mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La mayoría de los genes candidatos se expresaron en niveles más altos en las raíces que en las hojas, pero mostraron un perfil consistente en ambas especies. Entre los 20 unigenes supuestamente implicados en la síntesis de alcaloides esteroides, 14 ya eran conocidos. Identificamos tres nuevos candidatos a CYP450 (CYP76A2, CYP76B6 y CYP76AH1) y tres nuevos candidatos a factores de transcripción (ERF1A, bHLH13 y bHLH66). Proponemos que ERF1A, CYP90G1-1 y CYP76AH1 estén específicamente involucrados en los pasos clave de la biosíntesis de alcaloides esteroides en las raíces de V. maackii. Nuestros datos representan el primer análisis entre especies de la biosíntesis de alcaloides esteroides en el género Veratrum e indican que las propiedades metabólicas de V. maackii y V. nigrum están ampliamente conservadas a pesar de sus distintos perfiles de alcaloides.

Veratrum es un género que comprende ~ 40 especies de plantas herbáceas perennes que crecen ampliamente en las regiones templadas del hemisferio norte1,2. Aunque son tóxicas, las raíces de varias especies de Veratrum se utilizan, con precaución, en el contexto de la herboristería occidental y de la medicina tradicional china para el tratamiento de analgesia, inflamación3,4, tumores5,6,7, úlceras malignas8 y trombosis1. Los principales compuestos activos son los alcaloides esteroides como la jervina (y su derivado ciclopamina), la cevanina y la veratramina, que muestran una variedad de bioactividades médicamente relevantes en ensayos celulares y modelos animales9,10. La síntesis de alcaloides esteroides en especies de Veratrum requiere unidades isoprenoides producidas por las vías de mevalonato citosólico y MEP, que se convierten mediante varios pasos enzimáticos en escualeno, luego el cicloartenol intermedio cíclico y, finalmente, colesterol11,12,13. La conversión de colesterol en alcaloides esteroides requiere dos familias de genes principales: monooxigenasas del citocromo P450 (CYP450) y glicosiltransferasas (GT)14,15,16. Muchas de las enzimas implicadas en esta parte posterior de la vía se desconocen, al igual que los factores de transcripción que regulan la biosíntesis de alcaloides esteroides.

La transcriptómica comparada es un enfoque poderoso que puede identificar genes que codifican enzimas metabólicas y los factores de transcripción que las regulan comparando tejidos metabólicamente activos con controles que carecen de la vía de interés17,18. La correlación de los niveles de metabolitos con los datos de RNA-Seq identificó recientemente cuatro enzimas (incluidas tres CYP450) involucradas en la biosíntesis de alcaloides esteroides en Veratrum californicum19. Además, una comparación exhaustiva de los transcriptomas del tallo, la hoja y la raíz de Veratrum nigrum reveló 73 genes candidatos adicionales implicados en diversas partes de la vía, incluidas 11 enzimas en el segmento que va del cicloartenol al colesterol10. Aquí aplicamos un enfoque transcriptómico comparativo similar, pero incluimos dos especies de Veratrum con diferentes perfiles de alcaloides esteroides para investigar diferencias interespecíficas, así como componentes comunes de las vías de biosíntesis de alcaloides esteroides de Veratrum. Comparamos los transcriptomas de raíz y hoja de V. maackii y V. nigrum, y validamos las diferencias en la expresión génica mediante RT-PCR. Nuestros resultados proporcionan un valioso recurso genómico para el descubrimiento de nuevos genes relacionados con el metabolismo de los alcaloides esteroides.

Experimentos anteriores de RNA-Seq centrados en la biosíntesis de alcaloides esteroides de Veratrum han considerado solo especies individuales, por lo que han perdido la oportunidad de investigar diferencias interespecíficas, así como aspectos conservados de la vía metabólica10,19. Para abordar este problema, seleccionamos dos especies de Veratrum (V. maackii y V. nigrum) con diferentes perfiles de alcaloides, para maximizar la probabilidad de encontrar diferencias en la expresión genética subyacente. Medimos el contenido de jervine y ciclopamina en ambas plantas (Fig. 1). Jervine estuvo presente en todas las muestras pero fue significativamente (p < 0,05) más abundante en las raíces de V. maackii en comparación con las raíces de V. nigrum y con las hojas de ambas especies. Por el contrario, la ciclopamina fue significativamente (p < 0,05) más abundante en las raíces de V. nigrum en comparación con las raíces de V. maackii y en comparación con las hojas de ambas especies (donde apenas se detectó ciclopamina).

Contenido de alcaloides esteroideos de los tejidos de raíces y hojas en V. maackii y V. nigrum. Los datos son medias ± DE (n = 3). Barra negra: jervine, barra gris: ciclopamina. Letras minúsculas diferentes indican diferencias significativas (p < 0,05) según las pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. dw peso seco, raíces MR V. maackii, hojas ML V. maackii, raíces NR V. nigrum, hojas NL V. nigrum.

Se recolectaron tejidos de hojas y raíces de plantas de V. nigrum y V. maackii para análisis de RNA-Seq (tres réplicas biológicas de diferentes plantas). Obtuvimos 79,12 Gbp de lecturas limpias de las 12 muestras (Tabla 1). El contenido de GC de cada muestra fue de al menos 50,46% y el porcentaje de base Q30 fue de 92,23%. Después del procesamiento con el software Trinity, se ensamblaron 437.820 transcripciones con una longitud N50 de 871 pb y se identificaron 203.912 unigenes con una longitud promedio de 687 pb y una longitud N50 de 780 pb.

Los 203.912 unigenes se compararon con múltiples bases de datos públicas y 97.207 (47,67%) fueron anotados para todas las bases de datos (Tabla 2).

En la base de datos Nr, 86.569 unigenes (42,45%) tenían coincidencias significativas y se predijeron las especies homólogas. En consecuencia, 10,329 (12%) y 9741 (11%) unigenes se alinearon con las plantas monocotiledóneas Elaeis guineensis y Phoenix dactylifera, respectivamente (Figura complementaria S1A). Para V. nigrum, se anotaron 59,614 unigenes, 10,083 de los cuales coincidían con secuencias homólogas de Elaeis guineensis, seguido de Phoenix dactylifera (9442) y Musa acuminata (3909) (Figura complementaria S1B). Para V. maackii, se anotaron 60,387 unigenes, 9618 de los cuales coincidían con secuencias homólogas de Elaeis guineensis, seguido de Phoenix dactylifera (8926) y Neonectria ditissima (6434) (Figura complementaria S1C).

A continuación, los 43.611 (44,86%) unigenes anotados se agruparon en tres categorías de ontología genética (GO): proceso biológico, componente celular y función molecular (Fig. 2A). En la categoría de procesos biológicos, las tres subcategorías principales fueron “proceso metabólico” (23.391, 31,26%), “proceso celular” (20.911, 27,95%) y “localización” (6.048, 8,08%). En la categoría de componentes celulares, las tres subcategorías principales fueron “parte celular” (17.806, 23,34%), “célula” (17.662, 23,18%) y “orgánulo” (13.609, 17,79%). En la categoría de función molecular, las tres subcategorías principales fueron “actividad catalítica” (22.517, 44,36%), “unión” (21.693, 42,73%) y “actividad transportadora” (2618, 5,16%). Las anotaciones GO separadas para las dos especies reflejaron el perfil de anotación general. Para V. nigrum, se anotaron 30.303 unigenes en la base de datos GO, de los cuales 22.263 se clasificaron como procesos biológicos, 16.751 como componentes celulares y 24.764 como funciones moleculares (Fig. 2B). Para V. maackii, se anotaron 31.254 unigenes en la base de datos GO, de los cuales 23.191 se clasificaron como procesos biológicos, 17.524 como componentes celulares y 25.625 como funciones moleculares (Fig. 2C).

(A) Clasificación GO de todos los V. maackii y V. nigrum unigenes ensamblados; (B) Clasificación GO de todos los V. nigrum unigenes ensamblados; (C) Clasificación GO de todos los V. maackii unigenes ensamblados.

En la base de datos KOG, 54.907 (56,48%) unigenes fueron asignados a 26 categorías. La categoría más poblada (12.685 unigenes, 23,05%) fue “sólo predicción de función general”, seguida de “modificación postraduccional, recambio de proteínas y chaperonas” (6064, 11,04%) y “mecanismos de transducción de señales” (5317, 9,68%). Las categorías menos pobladas fueron "motilidad celular" (41, 0,075%) y "estructura nuclear" (268, 0,48%) (Fig. 3A). Nuevamente, las anotaciones separadas para las dos especies reflejaron el perfil de anotación general. Identificamos 35,966 anotaciones KOG que coinciden con V. nigrum y la categoría más poblada fue "solo predicción de función general" con 8394 unigenes (Fig. 3B). Identificamos 37,395 anotaciones KOG que coinciden con V. maackii y la categoría más poblada fue "solo predicción de función general" con 9285 unigenes (Fig. 3C).

(A) Clasificación de la función KOG de V. maackii y V. nigrum unigenes; (B) Clasificación de la función KOG de V. nigrum unigenes; (C) Clasificación de la función KOG de V. mackii unigenes.

Finalmente, se anotaron 21,581 unigenes en la base de datos KEGG y se asignaron a 121 vías biológicas (Tabla complementaria S1). Entre ellos, 6421 (29,75%) estaban involucrados en vías metabólicas, incluyendo principalmente “ribosoma” (1847, 8,5%), “metabolismo de purinas” (698, 3,23%) y “glucólisis/gluconeogénesis” (666, 3,09%) (Suplementario Figura S2A). Se anotaron números similares de unigenes en cada especie: 14.456 en V. nigrum y 14.815 en V. maackii. En ambas especies, la categoría "vías metabólicas" fue la más poblada (3526 en V. nigrum y 3395 en V. maackii) seguida de "biosíntesis de metabolitos secundarios" (1738 en V. nigrum y 1708 en V. maackii) (Figura complementaria .S2B,C).

La comparación transcriptómica de dos tejidos de dos especies brinda la oportunidad de definir los componentes de una vía metabólica específica de un tejido, pero también de evaluar las diferencias en la expresión genética entre especies que conducen a diferentes perfiles metabólicos, lo que no fue posible en estudios anteriores que involucraban un solo tejido. Especies de Veratrum10,19. Encontramos 3534 genes expresados diferencialmente (DEG) al comparar las raíces de V. maackii con las raíces de V. nigrum (MR vs NR), 2004 regulados positivamente y 1530 regulados negativamente en V. maackii. Es importante destacar que 1019 transcripciones solo estuvieron presentes en MR y otras 814 solo en NR, lo que indica diferencias cualitativas y cuantitativas en la comparación transcriptómica entre especies. También encontramos 5734 DEG al comparar hojas de V. maackii con hojas de V. nigrum (ML vs NL), 2919 reguladas al alza y 2815 reguladas a la baja en V. maackii. Como se indicó anteriormente, 1090 transcripciones solo estaban presentes en ML y otras 902 solo en NL.

La comparación de tejidos dentro de la especie reveló 3269 DEG al comparar raíces y hojas de V. maackii (MR vs ML), 1593 regulados positivamente y 1676 regulados negativamente en las raíces, incluidas 862 transcripciones que solo estaban presentes en MR y otras 339 solo presentes en ML. De manera similar, la comparación NR vs NL en V. nigrum reveló 1122 DEG, 263 regulados positivamente y 859 regulados negativamente en las raíces, incluidas 75 transcripciones que solo estaban presentes en NR y 124 solo presentes en ML (Fig. 4). Curiosamente, no se compartieron transcripciones entre los cuatro tipos de muestras.

Diagrama de Venn de genes expresados diferencialmente en las raíces y hojas de V. maackii y V. nigrum.

Examinamos las anotaciones GO y KEGG de los DEG para determinar cualquier diferencia dependiente de la especie o específica del tejido en las funciones genéticas. La categoría de proceso biológico GO “proceso metabólico” (GO:0008152) estaba más enriquecida en V. maackii que en V. nigrum. El proceso biológico GO clasifica “proceso de oxidación-reducción” (GO:0055114) y “procesamiento de ARNr” (GO:0006364), los componentes celulares GO “componente integral de la membrana” (GO:0016021), “membrana” (GO:0016020 ) y “cloroplasto” (GO:0009507), y las funciones moleculares “unión de ATP” (GO:0005524), “unión de iones metálicos” (GO:0046872) y “actividad oxidorreductasa” (GO:0016491) se enriquecieron en las hojas de ambas especies pero no en las raíces. Observamos diferencias importantes entre hojas y raíces en múltiples categorías GO (Tabla complementaria S2).

A continuación, identificamos las vías de KEGG enriquecidas para centrarnos en el metabolismo de los alcaloides esteroides (Tabla complementaria S3). Aproximadamente 100 vías se enriquecieron en las comparaciones MR vs NR, ML vs NL y MR vs ML, pero solo 50 en NR vs NL. Estos involucraron 263, 329, 499 y 185 unigenes, respectivamente. En MR versus NR, la “glucólisis/gluconeogénesis”, el “metabolismo de purinas” y la “fosforilación oxidativa” fueron las vías más enriquecidas, cada una con 18 unigenes. En ML vs NL, “ribosoma”, “metabolismo de purinas” y “glucólisis/gluconeogénesis” fueron las vías más enriquecidas, con 22, 20 y 19 unigenes, respectivamente. En MR vs ML, las categorías más enriquecidas fueron “fotosíntesis”, “fijación de carbono en organismos fotosintéticos” y “biosíntesis de fenilpropanoides”, con 58, 38 y 32 unigenes, respectivamente. De manera similar, en NR vs NL, las categorías más enriquecidas fueron “fotosíntesis”, “proteínas de antena de fotosíntesis” y “fijación de carbono en organismos fotosintéticos”, con 46, 24 y 22 unigenes, respectivamente. En la categoría altamente relevante de “biosíntesis de esteroides”, el mayor número de unigenes (cinco) se encontró en la comparación MR vs ML, mientras que las diferencias en las comparaciones MR vs NR y ML vs NL fueron insignificantes (dos unigenes). Estos datos sugieren que existe sólo una pequeña diferencia entre especies en términos de metabolismo de alcaloides esteroides, pero una gran diferencia entre los tejidos de las hojas y las raíces.

Uno de los beneficios del análisis RNA-Seq en el contexto de las vías metabólicas es que las diferencias en la expresión genética pueden identificar no solo las enzimas involucradas directamente en la vía metabólica sino también las proteínas reguladoras, especialmente los factores de transcripción (TF), que la controlan. Pudimos asignar 867 unigenes a 16 familias de genes TF de plantas conocidas, incluidas 168 (19,36%) pertenecientes a la familia MYB, 152 (17,55%) a la familia bZIP, 126 (14,56%) a la familia bHLH, 94 (10,85%) %) a la familia ERF y 92 (10,62%) a la familia C2H2 (fig. 5). Es importante destacar que 234 de los genes TF se expresaron diferencialmente, incluidos 131 al comparar MR con ML y 37 al comparar NR con NL, y la mayoría en ambos casos representa a la familia MYB (Figura complementaria S3). Otros 42 genes TF diferían al comparar MR con NR, y la mayoría representaba a la familia C2H2, seguida de MYB, AP2/ERF y bHLH. Además, 77 genes TF diferían al comparar ML con NL, y la mayoría representaba la familia de los dedos de zinc, seguidos de bHLH, WRKY, NAC, MYB, ARF, GATA, bZIP y C2H2 (Figura complementaria S4). Todos los genes bZIP, C2H2 y bHLH TF expresados diferencialmente estaban regulados positivamente en las raíces en comparación con las hojas en ambas especies (Figura complementaria S4).

Distribución de secuencias entre familias de factores de transcripción de V. maackii y V. nigrum.

Identificamos 444 unigenes anotados como CYP450, 139 de los cuales no pudieron asignarse a una familia. El resto fue asignado a nueve clanes y 41 familias (Tabla complementaria S5; Tabla complementaria S6). Las familias más abundantes fueron CYP71 y CYP76, representando en conjunto más de la mitad del total, lo que es consistente con la distribución de CYP encontrada en otras especies de plantas20. Encontramos que 153 de los unigenes CYP450 se expresaron diferencialmente, incluidos los CYP90B27, CYP90G1 (dos unigenes) y CYP94N previamente informados que pueden estar involucrados en la síntesis de ciclopamina19. Los unigenes CYP450 se expresaron en niveles más altos en las raíces que en las hojas en ambas especies.

Seleccionamos 20 genes candidatos entre los DEG que codifican enzimas y TF asociados con la vía de los alcaloides esteroides y validamos sus perfiles de expresión mediante RT-qPCR. Los 10 genes candidatos que codifican enzimas en la parte anterior de la vía de los alcaloides esteroides se expresaron en niveles más altos en las raíces que en las hojas de ambas especies (Fig. 6): 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMGS), 3 -hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGR), mevalonato quinasa (MK), difosfomevalonato quinasa (PMK), difosfomevalonato descarboxilasa (MVD), escualeno epoxidasa (SQE), cicloartenol sintasa (CAS, dos unigenes), ciclopropil isomerasa (CPI) ) y esterol 14-desmetilasa (CYP51). De manera similar, los siete genes candidatos de CYP450 se expresaron con más fuerza en las raíces que en las hojas: CYP90G1 (dos unigenes), CYP90B27, CYP94N, CYP76A2, CYP76B6 y CYP76AH1 (Fig. 7). Finalmente, entre los tres genes TF que probamos, ERF1A y bHLH66 se expresaron con más fuerza en las raíces, mientras que bHLH13 se expresó con más fuerza en las hojas, lo que sugiere que este último puede ser un regulador negativo (Fig. 7). Los resultados de RT-qPCR fueron consistentes con los datos de RNA-Seq para la mayoría de los genes candidatos, excepto que MVD se expresó en un nivel más alto en NL que NR y CAS2 se expresó en un nivel más alto en ML que en MR.

Análisis de 10 genes expresados diferencialmente que codifican enzimas involucradas en MVA y la síntesis de alcaloides esteroides en los tejidos de raíces y hojas de V. maackii y V. nigrum validados por qRT-PCR.

Análisis de siete genes CYP50 y tres factores de transcripción potencialmente implicados en la síntesis de alcaloides esteroides validados por qRT-PCR.

Las plantas de Veratrum producen una rica variedad de alcaloides esteroides, muchos de los cuales son de interés farmacéutico, y los perfiles de alcaloides de diferentes especies son únicos. Por ejemplo, el perfil de alcaloides esteroides de V. californicum incluye la acumulación significativa de ciclopamina en los rizomas, seguida de las raíces y los bulbos, lo que resulta en una diferencia de 20 veces entre los órganos subterráneos y aéreos19. Esto sugiere que los alcaloides esteroides de V. californicum se sintetizan en órganos subterráneos y se transportan a otras partes de la planta. La comparación de las raíces y hojas de V. californicum indicó un contenido de ciclopamina entre 20 y 100 veces mayor en las raíces21,22, pero esto varía considerablemente según el lugar de cosecha y la etapa de crecimiento22. De manera similar, se encontró que las raíces de V. nigrum acumulaban el doble de jervine que las hojas23. Como base para nuestros experimentos de RNA-Seq, ampliamos este análisis para incluir múltiples alcaloides y múltiples especies. Encontramos que V. nigrum y V. maackii mostraron perfiles opuestos para la acumulación de jervine y ciclopamina, con jervine acumulándose a niveles mucho más altos en las raíces de V. maackii en comparación con las hojas y con las raíces y hojas de V. nigrum, mientras que la ciclopamina fue más abundante en las raíces de V. nigrum en comparación con V. maackii y no se detectó en las hojas de ninguna de las especies. Estos resultados muestran que V. nigrum y V. maackii son buenos modelos para el análisis de diferencias interespecíficas en la acumulación de alcaloides, que podrían deberse a diversos factores, incluida la expresión diferencial de genes, la síntesis/estabilidad de proteínas, la actividad enzimática o la renovación del producto. Como se mencionó anteriormente, la acumulación de alcaloides está influenciada por factores ambientales y varía según la etapa de crecimiento y la estación. En la mayoría de los estudios no se menciona la temporada de recolección del material estudiado, pero nuestro estudio confirma el patrón observado para la ciclopamina en V. californicum donde los órganos subterráneos generalmente acumulan concentraciones de alcaloides más altas que los órganos aéreos19,22. En el caso del jervine esto es cierto para V. maackii, pero para V. nigrum la proporción es más equilibrada. Parece haber una tendencia a acumular más alcaloides hacia el otoño en las especies de Veratrum de zonas templadas, pero nuestros datos se basan en una sola recolección a principios de la primavera que representa solo una instantánea y la información sobre la dinámica de la acumulación de alcaloides en V. maackii y V. nigrum es desaparecido. Se desconocen las señales ambientales específicas que conducen a la estimulación de la biosíntesis de alcaloides, pero los reguladores maestros, como los factores de transcripción identificados, probablemente desempeñen un papel central en la cascada de señalización.

Reunimos bibliotecas de transcriptomas separadas para tejido de raíces y hojas en V. nigrum y V. maackii para facilitar el análisis transcriptómico comparativo de la expresión genética específica de tejido y dependiente de especie en el contexto de la biosíntesis de alcaloides esteroides. Esto amplía el análisis de V. nigrum realizado por Szeliga et al.10 aunque consideraron tres tejidos separados (raíz, hoja y tallo). La inclusión de dos tejidos aéreos refina el análisis, pero las principales distinciones relevantes resultantes de su trabajo fueron entre las raíces y otros tejidos, por lo que restringimos nuestro análisis a raíces versus hojas para reducir la cantidad de conjuntos de datos de transcriptomas. Esta simplificación nos permitió construir y analizar bibliotecas de transcriptomas más grandes en comparación con el estudio de Szeliga, lo que llevó al aislamiento de 132,155 y 109,287 unigenes en la raíz y la hoja de V. nigrum, respectivamente (Figura complementaria S5A), así como 124,802 y 101,035 en la raíz y la hoja de V. maackii, respectivamente (Figura complementaria S5B). En NR, NL, MR y ML, encontramos 43.608, 20.740, 43.927 y 20.160 unigenes, respectivamente (Figura complementaria S5A, B).

Szeliga y sus colegas anotaron sus conjuntos de datos de transcriptomas y encontraron más unigenes anotados en las hojas que en las raíces10. Por el contrario, encontramos más unigenes anotados en los transcriptomas de raíces de ambas especies) (Tabla complementaria S7). Ambos estudios encontraron la mayor cantidad de anotaciones en la base de datos Nr. Pudimos anotar 64.329 (66%) unigenes en MR, 43.151 (44%) en ML, 61.428 (63%) en NR y 46.139 (47%) en NL. También identificamos más unigenes que podrían anotarse en KEGG (21,581). Las diferencias entre nuestros resultados y los del estudio anterior de V. nigrum pueden reflejar las diferentes fuentes de plantas (plantas silvestres en nuestro estudio, pero plantas cultivadas en laboratorio en el estudio anterior10) y/o diferencias en el momento de la recolección de plantas para muestreo.

Como máximo el 12% de los unigenes tenían coincidencias homólogas con otras especies individuales. Este valor es demasiado bajo para fundamentar una relación filogenética estrecha. Sin embargo, la relación dentro de las monocotiledóneas está claramente indicada. Las plantas de cultivo generalmente están bien representadas en las bases de datos y, por lo tanto, no se deben sobrevalorar las mejores, Elaeis guineensis y Phoenix dactylifera. Un estudio previo sobre V. nigrum10 señala alineamientos con Oryza sativa, un cultivo monocotiledóneo, que también carece de alcaloides esteroides.

La biosíntesis de alcaloides esteroides se puede dividir en tres etapas: la vía ascendente del MVA que produce 2,3-oxidoscualeno, la conversión de cicloartenol en colesterol y la conversión de colesterol en alcaloides esteroides (Fig. 8)24,25. La primera etapa involucra seis enzimas clave (HMGS, HMGR, MK, PMK, MVD y SQE) y seleccionamos los genes correspondientes, que también fueron identificados por Szeliga et al.10. Descubrimos que la mayoría de estos genes se expresaban fuertemente en las raíces, con MVD como única excepción (Fig. 6). HMGR es un paso limitante de la velocidad en la vía MVA, que cataliza la transformación de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMGR-CoA) en mevalonato (MVA)26. La HMGR se expresó con más fuerza en las raíces que en las hojas en ambas especies, como se confirma en este documento y anteriormente10 mediante qRT-PCR. La segunda etapa de la síntesis de alcaloides esteroides involucra tres genes que codifican las enzimas CAS, CPI y CYP51. Encontramos que CPI y CYP51 se expresaron en niveles más altos en las raíces de ambas especies que en las hojas (Fig. 6). CPI cataliza la conversión de 31-norcicloartanol a 31-nor-24(25) dihidrolanosterol y CYP51 cataliza la 14α-desmetilación durante la reacción inicial de la biosíntesis de esteroles vegetales27. Tanto el CPI como el CYP51 participan en la biosíntesis del colesterol en plantas solanáceas25. Es importante destacar que el cicloartenol se considera el primer intermediario cíclico en la biosíntesis de alcaloides esteroides, pero en Arabidopsis thaliana se ha propuesto una vía alternativa que implica la conversión de 2,3-oxidoscualeno en lanosterol. La ausencia de transcripciones anotadas que codifiquen la lanosterol sintasa en nuestro conjunto de datos sugiere que esta vía alternativa no está presente o está presente pero está silenciada en V. nigrum y V. maackii, lo que confirma que los alcaloides esteroides se sintetizan a partir de cicloartenol en estas especies25,28.

Vía de biosíntesis de ciclopamina. AACT acetil-CoA C-acetiltransferasa, Acetoacetil-CoA acetoacetil coenzima A, Acetil-CoA acetil coenzima A, HMGCoA:3-hidroxi-3-metilglutaril CoA, HMGS hidroximetilglutaril-CoA sintasa, HMGR 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa, Mevalonato MVA, mevalonato quinasa MK, mevalonato-5-fosfato MVAP, fosfomevalonato quinasa PMK, difomevalonato descarboxilasa MVD, mevalonato-5-difosfomevalonato MVAPP, isopentenil difosfato IPP, geranilgeranil difosfato sintasa GPS, geranildifosfato GPP, farnesil difosfato sintasa FDS, farnesildifosfato FPP, SQS escualeno sintetasa, SQE escualeno epoxidasa, CAS cicloartenol sintasa, SSR2 esterol cadena lateral reductasa 2, SMO3 C-4 esterol metil oxidasa 3, CPI ciclopropilsterol isomerasa, CYP51 esterol C-14 desmetilasa, C14-R esterol C-14 reductasa, CYP51 esterol C -14 desmetilasa, SMO4 C-4 esterol metil oxidasa 4, C5-SD 2 esterol C-5(6) desaturasa 2, 7-DR2 7-deshidrocolesterol reductasa 2, CYP90B27 colesterol 22-hidroxilasa, CYP94N1 22-hidroxicolesterol 26-hidroxilasa/ oxidasa, GABAT1 22-hidroxicolesterol-26-al transaminasa, CYP90G1 22-hidroxi-26-aminocolesterol 22-oxidasa.

Para identificar los TF que regulan el metabolismo en V. maackii y V. nigrum29, seleccionamos unigenes anotados que representan diferentes familias de TF y descubrimos que los más abundantes eran MYB, bZIP, bHLH, AP2/ERF y C2H2. La clasificación difería ligeramente en las dos especies (V. maackii—MYB, C2H2, bZIP, bHLH, WRKY, NAC y AP2/ERF; V. nigrum—MYB, bZIP, WRKY, C2H2, AP2/ERF, GATA y bHLH) y también difirió de los resultados proporcionados por Szeliga y colegas (bHLH, C2H2, HD-ZIP, MYB y C3H), donde la familia bHLH se encontró solo en los tejidos del tallo y la raíz, mientras que la familia C2H2 solo se encontró en las hojas10. Por el contrario, encontramos que las familias bHLH y C2H2 se expresaban en raíces y hojas y estaban reguladas positivamente en las raíces en comparación con las hojas. Esta discrepancia puede reflejar las diferencias en las fuentes vegetales discutidas anteriormente y/o el mayor número de unigenes descubiertos en nuestro estudio.

Seleccionamos tres genes TF para su validación mediante qRT-PCR. El primero fue AP2/ERF, que se expresó en niveles significativamente más altos en las raíces que en las hojas de ambas especies y también se expresó en niveles significativamente más altos en V. maackii en comparación con las raíces de V. nigrum (MR vs NR), mientras que hubo una diferencia interespecífica no significativa en hojas (ML vs NL). La proteína AP2/ERF GAME9 es un TF en plantas solanáceas que puede interactuar con SIMYC2 para regular la expresión de genes anteriores como C5-SD (que codifica D(7)-sterol-C5(6)-destaurasa) para regular la síntesis de alcaloides glucósidos30. Es posible que AP2/ERF desempeñe un papel similar en las plantas Veratrum. La fuerte correlación entre la expresión de ERF1A y el contenido de ciclopamina en raíces y hojas de ambas especies sugiere que ERF1A regula específicamente la síntesis de ciclopamina en las raíces de V. maackii. Los otros dos candidatos son miembros de la familia bHLH, conocida por regular la síntesis de flavonoides y alcaloides31. Encontramos que bHLH13 y bHLH66 estaban más fuertemente regulados en las raíces de V. maackii, y que bHLH66 fue significativamente (p <0,05) más abundante en las raíces de ambas especies que en las hojas, pero especialmente en V. maackii (Fig. 7). Especulamos que ambos TF pueden regular la biosíntesis de alcaloides esteroides. La fuerte correlación entre la expresión de estos dos TF y el contenido de alcaloides esteroides indicó que bHLH13 podría regular la síntesis de ciclopamina, mientras que bHLH66 podría regular la conversión de ciclopamina en jervine. Pocos estudios previos han abordado la regulación transcripcional de la biosíntesis de alcaloides esteroides en V. nigrum10,19 y ninguno (hasta donde sabemos) en V. maackii, por lo que estos tres candidatos deberían examinarse con más detalle en estudios futuros para determinar sus funciones precisas.

La familia CYP450 es la familia de enzimas más grande en el metabolismo de las plantas y juega un papel clave en la diversificación y modificación funcional de los esqueletos de triterpenoides y esteroles32,33. Examinamos siete genes CYP450 expresados diferencialmente que pueden estar involucrados en la biosíntesis de alcaloides esteroides. Tres de ellos (CYP90B27, CYP90G1 y CYP94N1) catalizan la conversión de colesterol en intermediarios intermedios. CYP90B27 convierte el colesterol en 22 (R) -hidroxicolesterol, que se oxida en dos pasos para formar 22-hidroxicolesterol-26-al por CYP94N1. Otra enzima (GABAT1) convierte el 22-hidroxilcolesterol-26-al en 22-hidroxil-26-aminolcolesterol, que a su vez se convierte en 22-ceto-26-aminolcolesterol mediante CYP90G1 (Fig. 8). Descubrimos que las transcripciones de CYP90G1, CYP94N y CYP90B27 fueron significativamente (p <0,05) más abundantes en las raíces de V. maackii y V. nigrum que en las hojas (Fig. 7), lo que concuerda con informes anteriores19. La fuerte correlación entre la expresión de CYP90G1-1 y el contenido de alcaloides esteroides de los tejidos en ambas especies indicó que CYP90G1-1 podría ser la enzima clave para la biosíntesis de alcaloides esteroides en las raíces de V. maackii (Figs. 1 y 7). La raíz es la principal parte medicinal de la planta Veratrum debido a la acumulación de alcaloides esteroides34. Por lo tanto, se anticipa que las enzimas responsables de la decoración del esqueleto de alcaloides se expresarían predominantemente en las raíces. Tres unigenes CYP450 adicionales (CYP76A2, CYP76B6 y CYP76AH1), con fuerte expresión en las raíces según los datos de RNA-Seq, fueron validados mediante qRT-PCR (Fig. 7).

En la tercera etapa de la síntesis de alcaloides esteroides, las enzimas que convierten el 22-ceto-26-aminocolesterol en ciclopamina son generalmente desconocidas (Fig. 9). La verazina, el precursor previsto de la ciclopamina, probablemente se forma por la ciclación espontánea del 22-ceto-26-aminocolesterol, un intermedio reactivo. La verazina posiblemente sufre 16a-hidroxilación para formar etiolina catalizada por 16DOX y luego se reduce para formar teinemina y se convierte en solanidina en presencia de luz. La solanidina se oxida para formar epirrubijervina y se reduce en presencia de luz para formar husukinidina. Este último luego se transforma en ciclopamina y luego en jervine mediante reacciones de oxidación adicionales, o se reduce para formar veratramina11,35,36,37,38,39,40,41. Dada la correlación entre la expresión de CYP450 y la distribución de los alcaloides esteroides, especulamos que estas enzimas también participan en la parte final de la ruta de biosíntesis de los alcaloides esteroides. La fuerte correlación entre la expresión de CYP76AH1 y el contenido de alcaloides esteroides de los tejidos en ambas especies sugiere que CYP76AH1 está específicamente involucrado en el segmento final de la biosíntesis de alcaloides esteroides en las raíces de V. maackii (Figs. 1 y 7). Las funciones precisas de los tres nuevos genes candidatos CYP76A2, CYP76B6 y CYP76AH1 en la parte final de la vía de biosíntesis de alcaloides esteroides deben evaluarse con más detalle.

Vía propuesta para la conversión de 22-ceto-26-aminocolesterol en ciclopamina en plantas Veratrum.

En conclusión, combinamos el análisis RNA-Seq y la cuantificación de alcaloides esteroides específicos en dos tejidos de dos especies de Veratrum para facilitar la identificación rápida de genes que codifican enzimas y factores de transcripción relacionados con el metabolismo secundario en un género de plantas medicinales no modelo. Identificamos 97.207 V. nigrum y V. maackii unigenes que se anotaron utilizando las bases de datos Nr, GO, KOG y KECG, incluidos 3534 genes que se expresaron diferencialmente entre tejidos o entre especies. Descubrimos que 235 unigenes expresados diferencialmente codificaban enzimas con un papel potencial en la biosíntesis de alcaloides esteroides. Se identificaron rápidamente veinte unigenes supuestamente involucrados en la síntesis de alcaloides esteroides, incluidos 14 genes conocidos, tres nuevos genes candidatos que codifican CYP450 (CYP76A2, CYP76B6 y CYP76AH1) y tres nuevos genes candidatos que codifican TF (ERF1A, bHLH13 y bHLH66) mediante análisis comparativo del transcriptoma. . Proponemos que ERF1A, CYP90G1-1 y CYP76AH1 estén específicamente involucrados en los pasos clave de la biosíntesis de alcaloides esteroides en las raíces de V. maackii. Nuestros datos proporcionan una referencia valiosa para el estudio de las vías biosintéticas de los alcaloides esteroides en todas las especies de Veratrum, ayudando a identificar los genes implicados en la vía biosintética principal y también los responsables de los perfiles de alcaloides esteroides dependientes de las especies.

Se recolectaron plantas silvestres de V. nigrum y V. maackii en la montaña Changbai, en la provincia china de Jilin, en abril de 2018, de conformidad con el “Reglamento estatal sobre protección de plantas silvestres (n.º 687, 2017)”. La especie fue confirmada por un botánico (An Haicheng) y los comprobantes se depositaron en el herbario del Instituto Forestal de Jiujiang, provincia de Jiangxi, República Popular China (Números: AN0517, AN0587) (Fig. 10). Se utilizaron raíces y hojas para el análisis de alcaloides esteroides y la secuenciación del transcriptoma. Las muestras de plantas se congelaron en nitrógeno líquido y luego se almacenaron a -80 °C antes del aislamiento del ARN. Las muestras correspondientes fueron liofilizadas y pulverizadas para la extracción de alcaloides esteroides.

Veratrum nigrum y Veratrum maackii recolectados en la montaña Changbai en la provincia china de Jilin. (a – c) Plantas de Veratrum nigrum; (d – f) Plantas de Veratrum macchi. Los vales se depositaron en el herbario del Instituto Forestal de Jiujiang, provincia de Jiangxi, China (Números: AN0517, AN0587).

Remojamos 10 g de muestra liofilizada y pulverizada en 40 ml de etanol al 80% a temperatura ambiente durante 1 h, y luego en etanol al 95% (1:4 p/v) a 80 °C durante 2 h con agitación continua. El disolvente se recogió por filtración. El residuo de la muestra se extrajo nuevamente en etanol al 95% (1:10 p/v) en las mismas condiciones. Este procedimiento se repitió una tercera vez. Se combinaron los tres filtrados, se eliminó el etanol por evaporación y luego el extracto se disolvió en metanol para su posterior análisis. Las concentraciones de jervine y ciclopamina en el extracto se determinaron mediante HPLC-UV utilizando ciclopamina y jervine comerciales (LC Laboratories, Woburn, MA, EE. UU.) como compuestos de referencia42.

Todas las muestras se analizaron por triplicado. Se utilizó SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc., San José, EE. UU.) para el análisis estadístico y el trazado. ANOVA identificó diferencias significativas en el contenido de alcaloides dentro de los tejidos de raíces y hojas de las especies. Las comparaciones de rangos múltiples se realizaron utilizando las pruebas de comparación múltiple de Bonferroni y las diferentes letras minúsculas indican diferencias significativas (p <0,05).

El ARN total se extrajo de las 12 muestras utilizando el reactivo Trizol. La calidad y cantidad del ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro NanoPhotometer y la integridad del ARN se examinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Shanxi Boride Biotechnology llevó a cabo la construcción de la biblioteca y el análisis de RNA-Seq utilizando la plataforma Illumina HiSeq 2500. Se utilizaron Qubit2.0 y Agilent 2100 para determinar la concentración de la biblioteca y el tamaño del inserto, y se utilizó qPCR para la cuantificación de la biblioteca y el control de calidad. Se utilizó Trinity para ensamblar las secuencias de transcripción.

Se utilizó BLAST (valor E <1 × 10–5)43 para alinear unigenes con múltiples bases de datos de proteínas y nucleótidos: Nr (proteínas no redundantes RefSeq)44, GO (Gene Ontology)45, COG (Clusters of Orthologous Groups)46 , KOG (Grupos ortólogos eucariotas)47, KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto)48, Pfam (familia de proteínas)49, TrEMBL50 y SWISS-PROT51.

Los DEG se identificaron utilizando DESeq52. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se utilizó para determinar el umbral del valor p. Se aplicaron un FDR <0,01 y un cambio de veces (FC) ≥ 2 como criterios de selección para identificar DEG entre pares de muestras.

El ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra integrada (DiNing, Beijing, China). Los niveles de expresión de unigenes supuestamente involucrados en la síntesis de esteroles se controlaron mediante RT-qPCR utilizando las secuencias de cebadores enumeradas en la Tabla S1 (Tabla complementaria S8). El análisis RT-qPCR se realizó con un sistema de PCR en tiempo real Roche LightCycler480 utilizando SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, Tokio, Japón). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 95 °C durante 10 min, y 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 58 °C durante 1 min. El gen de actina (ACT) se utilizó como referencia interna y el nivel de expresión relativo de cada unigene se determinó mediante el método 2-ΔΔCt53.

Las muestras fueron recolectadas por un botánico acreditado (An Haicheng) de acuerdo con el “Reglamento del Estado sobre Protección de Plantas Silvestres (No 687, 2017)” y los comprobantes se depositaron en el herbario del Instituto Forestal de Jiujiang, provincia de Jiangxi, República Popular China (Números : AN0517, AN0587).

Todos los datos esenciales asociados con este manuscrito están disponibles como datos complementarios y en repositorios en línea en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA912756.

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Los autores agradecen al Dr. Liu Jingying por sus comentarios críticos, al Sr. An Haicheng por la recopilación y determinación de las especies de Veratrum y al Dr. Richard Twyman por la revisión y edición.

La financiación fue proporcionada por el Proyecto de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de la Provincia de Jilin (Subvención No. CXGC202105GH).

Estos autores contribuyeron igualmente: Dan Wang, Zhijing Yu y Meng Guan.

Laboratorio Provincial Clave de Biotecnología Agrícola de Jilin, Academia de Ciencias Agrícolas de Jilin, Changchun, 130033, Provincia de Jilin, República Popular China

Dan Wang, Zhijing Yu, Qinan Cai, Jia Wei y Rui Ma

VTT Technical Research Centre of Finland Ltd., PO Box 1000, 02044 VTT, Espoo, Finlandia

Kirsi-Marja Oksman-Caldentey y Heiko Rischer

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Northwest A & F, Yangling, 712100, República Popular China

Pengda Ma

Laboratorio clave de restauración de la ecología de la vegetación salino-alcalina, Ministerio de Educación, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Forestal del Noreste, Hexing Road 26, Harbin, República Popular de China

Meng Guan y Zheyong Xue

Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad de Yanbian, Yanji, 133000, provincia de Jilin, República Popular China

Y dinero

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ZY, LS y QC recogieron plantas de Veratrum y realizaron HPLC. DW y ZY realizaron Q-PCR, GM, PM y ZX realizaron análisis de datos. DW, RM y PM escribieron el borrador original, KMOC y HR diseñaron, revisaron y editaron el manuscrito. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Rui Ma o Heiko Rischer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wang, D., Yu, Z., Guan, M. et al. El análisis comparativo del transcriptoma de Veratrum maackii y Veratrum nigrum revela múltiples genes candidatos involucrados en la biosíntesis de alcaloides esteroides. Representante científico 13, 8198 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35429-5

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Recibido: 14 de enero de 2023

Aceptado: 17 de mayo de 2023

Publicado: 21 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35429-5

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